Význam cytogenetických vyšetření u solidních dětských tumorů

Význam cytogenetického vyšetření u solidních dětských tumorů Potvrzení nebo vyvrácení předběžné diagnózy Zpřesnění diagnostiky nádoru, která je často obtížná a tím umožnění zvolit odpovídající léčbu Zpětná kontrola účinku léčby dětských nádorů Možnost do hloubky zkoumat průběh nemoci a studovat její příznaky Určení genomického profilu (tj. zlepšení vědomostí o genetickém složení nádoru) tumoru

Metody molekulární cytogenetiky umožňující sledovat solidní tumory FISH – umožňuje sledovat strukturní a numerické změny chromozomů v interfázních buňkách. CGH (komparativní genomová hybridizace) – umožňuje vyšetřením DNA nádorových buněk zjistit přírůstek nebo ztrátu (amplifikaci nebo deleci) genetického materiálu na všech chromozomech.

Další metody cytogenetiky umožňující sledovat solidní tumory SKY (spektrální karyotypování) – umožňuje současnou vizualizaci všech lidských chromozomů, vhodné zejména pro identifikaci translokací. Průtoková cytometrie (flow cytometry) – je technologie, která zjišťuje vlastnosti buněk v tekuté suspenzi. Ve flow cytometru je zdrojem světla laser. Ten zajišťuje velmi koncentrovaný paprsek monochromatického světla.

Flow cytometr

Nádorové buňky Zhoubné nádory jsou sestaveny z heterogeních buněk. Jejich karyotyp není stálý, ale podléhá klonálním změnám chromozomů. Kromě patogenních klonů mohou být v nádorech přítomny buňky s normálním karyotypem. U solidních tumorů se buňky s normálním karyotypem vyskytují ve fibroblastech.

Meduloblastom Neuroblastom Ewingův sarkom Wilmsův tumor Dětské solidní tumory Meduloblastom Neuroblastom Ewingův sarkom Wilmsův tumor

Meduloblastom Výskyt Meduloblastomy jsou tumory vycházející ze zadní jamky lebeční, mají však tendenci k šíření i do jiných oblastí mozku, míchy nebo i mimo centrální nervový systém. Nejčastěji se vyskytují u dětí do 5. až 6. roku života. Tyto tumory jsou o něco málo častější u chlapců než u děvčat.

Meduloblastom Charakteristika Většina dětských meduloblastomů má nenormální karyotypy, většinou s opakující se delecí 17p a trisomií chromozomu 7. Kombinací G-pruhování, karyotypováním a komparativní genomovou hybridizací CGH bylo identifikováno frekventované přestavení i chromozomů 3, 14, 10 a 22.

Meduloblastom Cytogenetická analýza Vzorky jsou rozřezány, ošetřeny kolagenázou 200 U/ml a kultivovány na Iscove a AMNIOMAX médiu. Nádory jsou sklizeny podle mitotického indexu mezi 4. a 9. dnem. Sebrání chromozomů je uskutečněno po vystavení kultury kolcemidu (0,001 mikrog/ml na tkáňovou kulturu) po dobu 4 hodin. Buňky jsou ošetřeny 0,075 M KCl a fixovány v 3:1 metanolu a ledové kyselině octové. Cytogenetická analýza je provedena použitím standardního G-pruhování.

Meduloblastom Průtoková cytometrie Jaderné suspenze jsou připravovány z uložených, v parafínu zatavených nádorových tkání.

Meduloblastom Výsledky FISH slouží k důkazu přítomnosti abnormálních klonů s polysomií na jednom nebo více chromozomech. Flow cytometrická analýza ukazuje přítomnost triploidních a tetraploidních klonů u nádorů s nenormálním FISH výsledkem. Toto naznačuje, že přítomnost zvýšení počtu kopií chromozomů ve většině nádorů detekováné interfázní FISH analýzou může být příznakem přítomnosti polyploidních klonů. Použitím interfázního FISH a flow cytometrie je zvýšena přesnost obvyklých G-pruhovacích metod. A tím přesněji detekovány přítomnosti abnormálních klonů v nádorech.

Meduloblastom FISH na chromozomu 3. Centromerická sonda na řezu nádorové tkáně

Neuroblastom Neuroblastom je dětský nádor (nejčastěji u dětí do 1 roku) s chromozomovou delecí. Dochází zde k deleci 1p32-1p36 a ke změně ploidie a amplifikaci N-myc onkogenu. Vyskytuje se i nebalancovaný přírustek na chromozomu 17 a dále delece na oblasti 11q a 3p. Podtypy Jsou známy 3 podtypy neuroblastomu lišící se podle ploidie, amplifikace N-myc onkogenu, přítomnosti del(1)(p36) a dalšími kritériemi.

Neuroblastom Uložení Tyto tumory vycházejí z neurálních páteřních buněk sympatického nervového systému, který začíná u báze krku a končí u kostrče. Tumory se proto vyskytují podél tohoto řetězce, nejčastěji se však objevují v hrudníku.

Neuroblastom Metody vyšetření CGH - chromozomy v metafázi z kostní dřeně se přes noc inkubují v RPMI médiu s kolcemidem. Metafáze z metastázovaných lymfatických uzlin se smísí s 500 U kolagenázy a přes noc inkubují buď v RPMI nebo Hams F10 médiu s kolcemidem. Interfázní FISH - citlivá metoda byla použita pro detekci přírustků chromozomu 17 u neuroblastomu. Byla použita ke stanovení důležitosti chromozomu 17 u triploidie(3n) a diploidie/tetraploidie (2n/4n) u primárních tumorů. SKY - je také důležitá pomůcka pro identifikaci přírustků na chromozomu 17.

Neuroblastom Další metody vyšetření Průtoková cytometrie RxFISH - je nová FISH technika, která používá vyšetření založené na průtokově tříděných, různě označených gibboních chromozomech. Hybridizace těchto sond s lidskými chromozomy vyústí do specifických barevně pruhovaných vzorků pro každý lidský chromozom.

Detekce přírustku na chromozomu 17/17q – dvoubarevný interfázní FISH

Neuroblastom Výsledky CGH - Ztráta na 11q se ukázala u primárních tumorů a u metastázovaných ložisek. Tyto nádory měly nebalancovaný přírustek na 17q a ztrátu na zbytku 3p. G-pruhování nádorových buněk z kostní dřeně ukázalo, že ztráta a nárust na 11q a 17q genetického materiálu detekované CGH, vyústily z nebalancované translokace mezi chromozomy 11 a 17, se zlomovým bodem v 11q14 a 17q11.2. Zvýšený počet kopií chromozomu 17q v metastázovaných lymfatických uzlinách byl potvrzen FISHem metafázních a interfázních jader z metastázovaných lymfatických uzlin, použitím mapování RARA genem na 17q21.1. Při interfázním FISHi byla zjištěna spojitost mezi přírustkem chromozomu 17a 3n ploidií a nebyla zjištěna u 2n/4n skupiny.

G-pruhování (A,B) and RxFISH (C,D)

Neuroblastom FISH a G-pruhování A. FISH interfázních jader z metastázované lymfatické uzliny. Dvě sady signálů na tomto jádře představují hybridizaci sesterských chromatid. B. FISH metafázních chromozomů z lymfatických metastázovaných uzlin. Zleva doprava der(11)t(11;17), modifikace der(11)t(11;17) majících kopii RARA genu na každém rameni a 2 normální homologní chromozomy 17. FISH metafázických chromozomů indikovala přitomnost pěti kopií RARA genu ve většině buněk. C. G-pruhování metafázních chromozomů z kostní dřeně, normální chromozom 11, der(11)t(11;17) a dva normální chromozomy 17 jsou ukázány.

FISH a G-pruhování

Neuroblastom G-pruhování a FISH na chromozomech 3 a 7 nádorových buněk ukazují přítomnost nebalancované t(3,7).

Ewingův sarkom Výskyt Ewingův sarkom je druhým nejčastěji se vyskytujícím typem zhoubného nádoru kosti. Vyskytuje se často v plochých kostech, jako je pánev a žebra, stejně tak i v kostech horních a dolních končetin. Často se šíří do jiných kostí a plic. Toto onemocnění se obvykle vyskytuje mezi 10. a 20. rokem věku.

Ewingův sarkom Specifikace Ewingovy sarkomy se vyznačují specifickými chromozomálními aberacemi postihujícími 22. chromozom - t(11;22) nebo komplexní translokace postihující 11. a 22. chromozom. Může se vyskytnout i trisomie chromozomu 8 a další abnormality. Specifické chromozomové abnormality mají často souvislost s částečným morfologickým nebo fenotypovým podtypem tumoru a hrají důležitou roli v prognóze. Předpokládá se, že fúzní protein podmíněný těmito translokacemi, kde se spojí část genu EWS s částí FL-1, ERG, ETV-1 nebo EIAF, se významně podílí na vzniku těchto nádorů. Kromě výše uvedených translokací se mohou u ES vyskytovat sekundární chromozomální aberace. Dále je u těchto nádorů nacházena zvýšená exprese produktů onkogenů (onkoproteinů) c-myc, c-myb a c-mil/c-raf a bývá amplifikován gen c-myc.

Ewingův sarkom Metody vyšetření Cytogenetické vyšetření je upřednostněno oproti fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) a polymerázové řetězové reakci (PCR), protože umožňuje zachytit všechny větší chromozomální aberace. Tak lze jedním vyšetřením detekovat například t(11;22), t(21;22), t(7;22), nebo t(17;22), což molekulárně biologické metody neumožňují. Cytogenetické vyšetření lze zpřesnit pomocí FISH za použití tzv. malovacích sond pro jednotlivé chromozomy. Jedná se o sondy hybridizující s mnohočetnými chromozomálními sekvencemi, kterými lze označit celý chromozom. Lze použít dvě nebo dokonce tři různobarevně značené sondy. Nevýhodou cytogenetického vyšetření je technická obtížnost kultivace nádorových buněk zvláště ze solidních nádorů.

Ewingův sarkom Metody vyšetření (pokračování) FISH lze hodnotit jak v mitóze, tak v interfázi. Pokud máme k dispozici dvě různě značené sondy proti oblastem, které se nacházejí na obou chromozomech blízko oblasti zlomu, získáme u normální buňky čtyři signály, vždy po dvou signálech stejné barvy. U buňky s hledanou translokací je místo jedné dvojice fúzní signál, jehož barva odpovídá kombinaci barev obou signálů. Někdy lze jako kontrolu použít dvě sondy lokalizované na stejném chromozomu blízko před zlomovým místem a za ním, které se v interfázi u netranslokovaného chromozomu jeví jako jeden bod a u translokovaného jako body dva. Tímto přístupem lze prokázat zda je příslušná část oddělena (deletována nebo translokována) ne však zda a s kterým chromozomem fúzuje.

Ewingův sarkom Metody vyšetření (pokračování) Reversní transkripce PCR (RT PCR) - detekuje t(11;22)(q24;q12) a t(21;22)(q24;q12). Použití této metody je nutné vzhledem k variabilitě zlomových míst. Velikost produktu vzniklého amplifikací při RT PCR s primery lokalizovanými na 11. a 22. chromozomu umožňuje zjistit, který typ translokace je ve vzorku přítomen. RT PCR umožňuje velmi citlivě diagnostikovat přítomnost nádorových buněk. Citlivost průkazu lze ještě zvýšit použitím tzv. uhnízděné („nested“) PCR. Jde o PCR reakci z produktu prvního kola PCR s primery, které leží uvnitř tohoto produktu. SKY CGH

Ewingův sarkom A.SKY potvrdilo reciproké t(16,22). B. FISH také potvrdil přítomnost reciproké t(16,22). FISH výsledek ukazuje abnormální metafáze. C. G karyotypování

Wilmsův tumor Výskyt a specifikace WT je vzácný pevný tumor vycházející z ledviny, který téměř zásadně postihuje děti a je spojen s geneticky determinovanými vrozenými vadami. Při této nemoci dochází nejčastěji k deleci v oblasti 11p13 a 11p15. Na pruhu 11p13 je přítomen antionkogen WT1. Další běžné abnormality zahrnují trisomie chromozomů 6,7,8,12,18 a 20 a strukturální abnormality na 1p, 1q, 11p a 16q U Wilmsova tumoru jsou vyskytují i nebalancované translokace vytvářející trisomii 1q. Nebalancovaná translokace, která vyústí do der(16)t(1q;16q) chromozomu je reprezentována ve více než půlce translokaci u WT. Tato translokace byla zkoumána FISH analýzou a ukázalo se, že může mít různé zlomové body.

Karyotyp ukazující der(16)t(1;16)(q12;q11.2) chromozom