prenatální diagnostika Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3. LF UK

Základní metody PD Neinvazivní: Biochemický screening UZ vyšetření Prevence určitých těžkých VVV Vyšetření séra Prvotrimestrální vs druhotrimestrální screening UZ vyšetření Invazivní Biopsie choriových klků (I. trimestr) Amniocentéza (II. trimestr) Kordocentéza (III. trimestr) Patologické nálezy neinvazivního vyšetření jsou indikací k invazi

Přehled markerů pro biochemický screening v séru těhotných žen Vyšetření Místo biosyntézy markerů Embryo a plod Alfa-fetoprotein (AFP) Žloutkový vak, gastrointestinální systém, játra embrya a plodu, ledviny a placenta (v malém množství Placenta hCG Syncytiotrofoblast (během celé gravidity) PAPP-A Syncitiotrofoblast (syntéza prokázaná od začátku gravidity do 20. týdne gravidity Nekonjugovaný estriol (uE3) Fetoplacentární jednotka (během celé gravidity) Nejprve přehled biochemických markerů vyšetřovaných v I. i II. Trimestru. K markerům, které mohou signalizovat vyšší riziko postižení embrya či plodu těžkými chr. Podmíněnými VVV patří AFP, některé z placentárních proteinů a nekonjugovaný estriol. Hájek Z, Kulovaný E, Macek M. Grada Publishing, spol. s. r. o., 2000

Biochemické markery: AFP Syntéza prokazatelná od 29. dne po početí Syntéza ve žloutkovém vaku, gastrointestinálním traktu – především v játrech, méně v ledvinách a placentě Hladina AFP: prudký nárůst do 10. – 13. týdne, prudký pokles po 16. a 32. – 34. t. gravidity - plodová voda - odpovídá vývoji syntézy u plodu - v séru – pozvolný vzestup do 28. – 32. týdne, poté prudký pokles (↑ propustnost placenty pro AFP v průběhu gravidity) Fce: imunoregulace, ochrana plodu před IS matky AFP je jediný marker, který odráží především poruchy metabolismu plodu a poruchy vývoje placenty Do plodové vody přechází AFP fyziologicky přes ledvniny plodu do moče a pak do plodové vody

Lidský choriový gonadotropin 2 podjednotky: α a β Pro diagnostiku: degradační produkty β-hCG podj. „nicked hCG – částečné rozevření řetězce β podj. → β-core hCG - finální degradační produkt Syntéza: syncytiotrofoblast hCG - ↑ do 11. t., pokles o 80%, na této úrovni do konce g. Hladina obou volných podjednotek hCG - 0,5% hladiny hCG Alfa-podjednotka – nárůst hladiny v průběhu celé g. β-podjednotka – ↑ do 10. t., ↓ do 22. t., mírný ↑ do 32. t., poté pokles do konce gravidity Fce: udržení syntézy progesteronu v corpus luteum, podpora syntézy testosteronu fetálních varlat Vyšetření v séru, ale i moči těhotných Diagnosticky důležité degradační produkty hCG. Částečným rozevřením beta-hCG vznikne „nicked hCG“ o stejné molekulové hmotnosti, jakou má intaktní hCG. Konečným degradačním produktem hCG se ztrátou velké části molekuly beta-podjednotky je beta-core hCG.

PAPP-A (Pregnancy Associated Plasma Protein A) Nejperspektivnější marker pro prvotrim. screening Syntéza: syncytiotrofoblast Hladina: ↑ od 5. do 18. týdne Fce zatím neznámá, pravděpodobně vliv na embryogenezi

Nekonjugovaný estriol (uE3) Syntéza fetoplacentární jednotkou, odráží metabolickou aktivitu f. j. Většina estriolu - konjugace v játrech matky Diagnostika: nekonjugovaná frakce (~ 10% z estriolu), 60 – 70% vázána na protein (sex hormone binding globulin) Kouření snižuje hladiny uE3 o 15% Měření nekonjugované frakce – součást základního screeningových programů ve II. Trimestru ↓ uE3 -základ ývoj plodu s Downovým s., s hypofunkcí nadledvin a anencefalií, příčinou snížených hladin uE3 je nezralost fetálních nadledvin a jater http://www.colorado.edu/intphys/iphy4480tsai/fet-matunit.jpg

Hodnocení hladin markerů MoM (multiples of median) Nejprve stanovení hladin jednotlivých biochemických markerů v průběhu fyziolog. gravidity → u postižených plodů – stanovení výše odchylky od normy, vyjádřeno v násobcích hodnot mediánu (MoM) Percentily – porovnání hodnoty jedince s hodnotami referenční populace Např.: pravděpodobnost 0,98 (98. percentil) - v referenční populaci jsou pouze 2 % jedinců s hodnotami vyššími.

UZ screening chromozomálně podmíněných vad (Downova syndromu) Prosáknutí záhlaví plodu = nuchální translucence (NT) Přítomnost nosní kůstky Zkrácení délky femuru Změna 5. prstu rukou Téměř 50% - srdeční vada Obr.: Prosáknutí záhlaví plodu tzv. nuchální translucence je nejvýznamnějším znakem rizika postižení plodu Downovým syndromem (http://www2.ocn.ne.jp/~baba/us-NT.htm).

Pravděpodobnost spontánního zániku plodu s prenatálně diagnostikovanými chr. aberacemi Typ vady Spontánní zánik plodu (%) Trizomie 21 30 Trizomie 18 68 Monozomie X 75 47, XXX 47, XXY 8 47, XYY 3 Vyvážené strukturální aberace Jde o údaje o vývoji těhotenství, která se – přes prokázaný vývoj plodu s chromozomálními aberacemi – rodiče rozhodli nepřerušit (Hook et al., 1978)

Screening chromozomálně podmíněných vad Screening v I. Trimestru a časných fázích II. trimestru (11. – 13. t. – jen spec. centra) AFP, free beta-hCG, nově PAPP-A Snížení stresu pro ženy Screening ve II. Trimestru – dostupný všude Triple test: AFP, hCG, uE3

Diagnostická efektivita (%) Screening chromozomálně podmíněných vad: biochemický screening v I. trimestru a na začátku II. trimestru Záchyt Downova sydromu ↑ β-hCG, nejcennější marker do 14. t. (sérum, moč) ↓ PAPP-A, do 14. t., v kombinaci s věkem matky záchyt až 71 % ↓ AFP - 18% gravidit s Downovým syndromem, širší rozptyl hladin Diagnostická efektivita bioch. markerů u m. Down, 11. – 14. týden gravidity Vyšetření volné beta-podjednotky hCG patří k nejcennějším markerům screeningu v I. Trimestru a časných fázích II. Trimestru do 14. t. AFP není vhodný pro prvotrimestrální screening Markery Diagnostická efektivita (%) AFP 32 uE3 36 β-hCG 57 PAPP-A 50

Screening chromozomálně podmíněných vad: kombinovaný screening v I Screening chromozomálně podmíněných vad: kombinovaný screening v I. trimestru a na zač. II. trimestru Kombinace poz. screeningu PAPP-A a beta-hCG s věkem matky záchyt až 62 – 82% případů Downova syndromu při 5% limitu falešné pozitivity + kombinace se zvýšenou nuchální translucencí – záchyt až 90% gravidit s těžkými chr. pod. vadami (11. – 14. t.) Příklad záchytu Downova syndromu screeningem ve 13. t. gravidity ↑ NT…………………………… 2,5 mm > 97. percentil ↑Beta-hCG………………… IU/ml = 95. percentil ↓PAPP-A …………………. 5 mg/ml = 5. percentil

Screening chromozomálně podmíněných vad: biochemický screening v I Screening chromozomálně podmíněných vad: biochemický screening v I. trimestru Trizomie 18 ↓ PAPP-A ↓ beta-hCG, x Downův syndrom Trizomie 13, trizomie chr. X a triploidie

Screening chromozomálně podmíněných vad: biochemický screening v II Screening chromozomálně podmíněných vad: biochemický screening v II. trimestru Spolehlivější oproti prvotrimestrálnímu screeningu Využití screeningových počítačových programů Stanovení rizika aneuploidie: Triple test v 15. – 20. týdnu ↓ AFP ↑ hCG ↓ uE3 + věk → záchyt až 60,2% ± 7,4% Downův syndrom: ↑ β-hCG in serum ↑ β-core hCG v moči – nejcitlivější mezi 17. – 21. t., až 80% efektivita záchytu

Screening chromozomálně podmíněných vad: biochemický screening v II Screening chromozomálně podmíněných vad: biochemický screening v II. trimestru Ostatní aneuploidie ↓ AFP ↑ hCG ↑ β-hCG u triploidií, Turnerova syndromu Trizomie 18 ↓ uE3- nejspolehlivější test vývoje plodu s trizomií 18 ↓ β-hCG ↓ β-core hCG v moči Do moče těhotných rychle proniká malá mlkla beta-hCG – spolehlivý marker aneuploidie, zvýšení u Downa, snížení u trizomie 18 V ledvinách – vytvoření finálního metabolitu hCG – beta-core hCG

Biochemický screening rozštěpových vad nervové trubice a dalších poruch ve II. tr. Poruchy uzávěru nervové trubice – nejčastější VVV Anencefalie, exencefalie, iniencafilie, encefalokéla, hydrocefalus, meningokéla, meningomyelokéla Frekvence 1-8/1000 NOVOROZENCŮ Většina těchto VVV děděna multifaktoriálně (stav matky, výživa, léky) s genetickým rizikem okolo 3% Často provázeny postižením plodu chromozomálními aberacemi ↑ AFP v séru – patologicky zvýšená propustnost fetoplacentární bariéry, kombinace s UZ diagnostikou Optimálně v 16. t. (16. – 18. t.) Prevence: vitamin D, riboflavin, vitamin C a kys. listová Únik AFP z plodu přes kůži, ledviny, placentu i plíce

Biochemický screening dalších patologií ↑ hCG Porucha uzávěru přední stěny břišní (IUGR, hypertenze těhotné, zánik plodu) Hydrops plodu ↓ hCG Ektopická gravidita, hrozící potrat Riziko vývoje karcinomu dělohy, varlat, vaječníků atd.

UZ diagnostika závažných VVV Anomálie CNS – obvykle zjevné před 24. t. Anencefalie – nejčastější (1 - 4:1000), důsledek selhání uzavření neurální trubice Srdeční vady plodu Vrozené vady uropoetického traktu Vady cervikální oblast, hrudníku a zažívacího traktu Defekty přední dutiny břišní VV skeletu plodu Další malformity Anencefalie – nepřítomnost mozku

Diagnostika preeklampsie Těhotenstvím podmíněná hypertenze s proteinurií a případně edémy po 20. týdnu gravidity Postihuje až 7% gravidit Diagnostika obvykle až po nástupu klinických příznaků ! Včasná diagnostika Etiologie: Porucha exprese adhezivních molekul cytotrofoblastu → nedostatečná invaze trofoblastu do děložních spirálních artérií → průsvit cév v myometriu úzký → snížení uteroplacentární perfuze Ischemická placenta poškozuje plod, uvolněné toxické látky a regulační faktory (TXA2) i matku Anencefalie – nepřítomnost mozku

Včasná diagnostika preeklampsie ↓ PP-13 (placental protein 13) – slibný marker predikce placentárních dysfunkcí ↓ ADAM 12 ↓PAPP-A PP13 – důležitý pro normální implantaci a remodelaci mateřských artérií Sérová koncentrace PP-13 v I. trimestru (Chafetz et al., 2007)

Včasná diagnostika preeklampsie Angiogeneze – patologický oxidační stav souvisí s inhibicí angiogeneze Klíčová mlkla: VEGF-A (vaskulární endoteliální růstový faktor A), aktivace 2 receptorů tyrozinkinázy: VEGFR1 = sFlt-1 (fms-like tyrosinkinása 1) – ↑ produkce, antagonistou proangiogenních VEGF (endoteliální faktor), PIGF (placentální růstový faktor) U PET – ↑sFlt-1, ↓PIGF – až několik týdnů před onsetem, včetně I. trimestru oproti fyziologickým graviditám Anencefalie – nepřítomnost mozku

Invazivní vyšetření Zisk biologického materiálu pro vyšetření Vyšetření chr. abnormalit Defektů neurální trubice Biochemická onemocnění, infekcí a HON Riziko 0,5 – 1% potratu plodu Anencefalie – nepřítomnost mozku

Invazivní vyšetření Indikace pro cytogenetické vyšetření: Věk matky nad 35 let Narození dítěte s chr. aberací v předchozí graviditě Pozitivní biochemický screening v I. a II. trimestru Zvýšené hodnoty NT v 10. – 14. týdnu a další patologické výsledky UZ Nevysvětlené poruchy reprodukce Opakované spontánní potraty Porod dítěte s mnohočetnými VVV v předchozí graviditě Patologický průběh gravidity (gestóza, IUGR) Expozice rodičů mutagenům Porod dítěte se syndromem lomivosti chromozomů nebo se syndromem fragilního chromozómu X Anencefalie – nepřítomnost mozku

Amniocentéza Odběr plodové vody z amniální dutiny Na tvorbě plodové vody se podílejí: Mateřská plazma přímou filtrací Fetální plazma průnikem kůží plodu Sekret z tracheobronchiálního kmene Ledviny plodu Filtrace z pupečníku Zdroj buněk pro cytogenetickou analýzu: pokožka těla plodu Základní metoda PD, v ČR 90,2% výkonů v letech 2002-2003 (Víšková a Calda, 2004) Klasické provedeni 15. – 16. týden, časná mezi 11. – 14. týdnem Transabdominálně pod UZ kontrolou Schéma amniocentézy ve II. Trimestru těhotenství pod kontrolou UZ. (http://amniocentesis.upmc.com/Images/Sub/ImageAmnio.jpg)

Biopsie choriových klků Indikace: Riziko X-vázaných onemocnění a Riziko monogenně dědičných VVV Konec I. trimestru – od 10. – 13. týdne Transabdominální CVS, bezpečnější a praktičtější než dříve používaná transcervikální CVS http://www.pregnancy-calendars.net/images/cvs.jpg

Kordocentéza Přímý odběr fetální krve z pupečníku (v. umbilicalis) Obvykle až po 20. t., nevhodná po 34. t., pod kontrolou UZ Diagnostické indikace: Rychlá karyotypizace plodu (IUGR, selhání cytodiagnostiky po CVS a AMC, suspektní VVV) Suspektní infekce plodu (parvovirus) Závažná Rh-aloimunizace plodu (diagnostika fetální anémie: stanovení Rh faktoru plodu, krevní obraz) – často přechází do výkonu terapeutického Terapeutické indikace: Intraumbilikální transfuze plodu při Rh-aloimunizaci Aplikace léků plodu (sedativa při terapeut. výkonech, aplikaci léků či intravaskulární transfuzi plodu)

Neinvazivní prenatální diagnostika založená na přítomnosti extracelulárních nukleových kyselin v mateřské cirkulaci

Placenta: obousměrný prostup mezi matkou a plodem Placenta – není nepropustná Přes placentu prochází buňky Prostup buněk – fetální vs maternální mikrochimérizmus Fetální extracelulární NK v mateřské cirkulaci – základ pro NIPD

Fetální mikrochimérizmus (prostup fetálních buněk přes placentu do mateřské cirkulace) Erytroblasty (jediné neperzistují, ale problém identifikace) Buňky trofoblastu Kmenové buňky hematopoetického a mezenchymálního původu Přihojení v kostní dřeni matky, osídlení řady mateřských tkání, tkáňová diferenciace v místě určení Podíl na reparaci poškozené tkáně? (Wang et al., 2004)

Fetální mikrochimérizmus ? Role v patogenezi některých autoimunitních onemocnění nebo spíše podíl na reparaci poškozené tkáně? ↑ výskyt fetálních buněk a/nebo DNA v mateřských tkáních a/nebo v PK (systémová sklerodermie, Gravesova choroba, revmatoidní artritida) Hromadnikova et al. Joint Bone Spine 2008; 75: 563 – 566. Protektivní účinek proti rozvoji karcinomu prsu a dalších maligních onemocnění ↓ výskyt fetálních buněk v PK (real-time PCR, DYS-14) Gadi et al. Microchimerism and Cancer 2008.

Fetální mikrochimérizmus – komplikace pro využití v NIPD Ideální cíl pro karyotypizaci ALE: Problém separace buněk Malé množství buněk – pouze 1 buňka/1 ml mateřské PK Specifický fetální marker Perzistence do dalších gravidit – až desítky let Kromě erytroblastů, problém specifického markeru Velice technicky náročné → využití fetálních extracelulárních NK (DNA a RNA) v NIPD

Fetální extracelulární NK (DNA + RNA) v mateřské cirkulaci Původ: Remodelace placenty (proliferace x apoptóza) - apoptotická tělíska placentárního trofoblastu v mateřské cirkulaci ochrana DNA a RNA před degradací

cffDNA (cell-free fetal DNA) v mateřské cirkulaci Výskyt poprvé prokázán v roce 1997 (Lo et al.), detekce DYS-14 genu na Y chromozómu u gravidit s ♂ pohlavím plodu Přítomnost prokázána od 5. týdne gravidity Po porodu se v mateřské cirkulaci nevyskytuje Tvoří 1-3% celkové DNA (mateřská + fetální) → detekce paternálních alel u plodu na směsné extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy pomocí real-time PCR

Fragmentace cffDNA Původ cffDNA – apoptotická tělíska placentárního trofoblastu → cffDNA je fragmentovaná Lze využít tohoto fenoménu pro účely NIPD → zvýšit podíl fetální extracelulární DNA ve vzorku?

Kvantifikace fetální extracelulární DNA (SRY amplifikace) v neseparované DNA a jednotlivých frakcích po separaci Plus HPA a Kell pacienti cffDNA je fragmentována (původem z apoptotických tělísek)

Kvantifikace celkové extracelulární DNA (GLO amplifikace) v neseparované DNA a jednotlivých frakcích po separaci Plus HPA a Kell pacienti

Procentuální zastoupení fetální DNA v celkové extracelulární DNA před a po separaci

Fragmentace Hlavní podíl cffDNA je ve fragmentech o velikosti 100-300 bp a 300-500 bp Zkoncentracování fetální DNA v jednotlivých frakcích frakce 100-300 bp 4,2x (0,8 – 16,7x) frakce 300-500 bp 2,5x (0-8,1x) Separace pomocí gelové elektroforézy ale není vhodná pro rutinní účely – riziko kontaminace biologického materiálu, pracnost a časová náročnost Experimentální využití např. u neinvazivní detekce fetálních bodových mutací (achondroplázie, β-talasémie)

Nevýhody detekce cffDNA ↓ koncentrace v mateřské cirkulaci Pouze 1-2% celkové DNA Detekce paternálních alel u plodu na směsné extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy → Zájem nalézt univerzální fetální marker Na základě epigenetických rozdílů mezi matkou a plodem Exprese genů, které jsou transkripčně aktivní pouze v placentě → fetálně specifické mRNA

Univerzální fetální marker Průkaz přítomnosti fetální DNA v plazmě při stanovení paternálních alel u plodu 2. Kvantifikace u placentárních dysfunkcí

RASSF1A gen jako univerzální fetální marker Chromozóm 3; 3p21.3 Promotor RASSF1A genu Hypermetylace ve fetální části placenty vs hypometylace v mateřské PK a tkáních Fetální DNA (~1% celkové DNA) Fetální DNA (beze změny) BstUI enzym Mateřská DNA(~99% celkové DNA) Mateřská DNA (rozštěpená)

Objev extracelulární fetální RNA Objev ZFY mRNA u gravidit s ♂ Poon et al., 2000 ZFY = zinc finger protein, na Y chromozómu Relativně stabilní (v apopt. těl., chráněna před všudypřítomnými RNázami) Exprese genů, které jsou transkripčně aktivní pouze v placentě → fetálně specifické Lze detekovat od 8. týdne gravidity

Extracelulární fetální RNA Detekovány placentárně specifické transkripty genů pro: hPL (lidský placentární laktogen) Detekce v průběhu celé gravidity, zvyšování koncetrace se ↑ gestačním období βhCG (beta podjednotka lidského choriového gonadotropinu) 100%, 42% a 7,7% v I., II. a III. Trimestru Korelace s koncentrací proteinů v mateřském séru hPL mRNA po porodu nelze detekovat do 24h Ng et al., 2003

Rutinní (v některých evropských zemích) Využití cffDNA v NIPD Rutinní (v některých evropských zemích) Detekce Rh faktoru plodu - RHD a RHCE genotypizace: riziko fetální erytroblastózy a HON u aloimunizovaných gravidit (anti-D, anti-c, anti-C, anti-E) Určení pohlaví plodu - detekce SRY genu: riziko výskytu X-vázaných chorob a kongenitální adrenální hyperplázie u plodu

Využití extracel. fetálních NK v NIPD Experimentální NIPD chromozomálních aneuploidií u plodu - Trisomie 21, Trisomie 18, Trisomie 13 Detekce onemocnění asociovaných s monogenní mutací - paternální AD nebo AR dědičnost: achondroplázie, β-talasémie, Huntingtonovo chorea) Kvantitativní analýza extracelulárních nukleových kys. - zvýšené množství u placentárních dysfunkcí (preeklampsie, IUGR) a dalších komplikací těhotenství