Milada Teplá, Helena Klímová Replikace DNA Tato prezentace se zabývá Replikací DNA. Milada Teplá, Helena Klímová KUDCH, PřF UK v Praze 2013

Nově syntetizovaný řetězec DNA Templát (matrice) A T G C A T G C A T G C Nově syntetizovaný řetězec DNA

Replikační počátky a replikační vidličky Celý proces replikace začíná v replikačních počátcích. Replikační počátek dvoušroubovice DNA Replikační počátky se zvětšují za vzniku tzv. replikačních vidliček. Lidský genom, který má přibližně 3x109 deoxynukleotidů, má zhruba 10 000 replikačních počátků. Jejich velký počet umožňuje lidské buňce zreplikovat veškerou DNA během relativně krátké doby. Replikační vidlička

Replikační vidličky: Helikasa = enzym, rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu Enzym helikasa se pohybuje podél DNA a současně rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu DNA. Na jednořetězcovou DNA nasedají SSB-proteiny (single-strand binding proteins), které ochraňují DNA před znovuspárováním.

Replikační vidličky: obousměrnost replikace V jednom replikačním počátku se vytvoří dvě replikační vidličky. Replikace je obousměrná. Replikační vidlička Směr replikace Směr replikace Začátek replikace

Syntéza DNA 3' 3' 5' 5' T A T A A T A T G C G C 5' 5' 3' Templátový Řetězec (DNA) T A T A Nově syntetizovaný Řetězec (DNA) A T A T Energie uvolněná hydrolýzou jedné fosfodiesterové vazby v deoxynukleosidtrifosfátu je dostatečná pro kondenzační reakci, při které se váže deoxynukleotidový monomer (dAMP, dTMP, dGMP a dCMP) do nově syntetizovaného řetězce za současného uvolnění difosfátu. 3'-konec 5'-konec G C G C Fosfodiesterová vazba 5' 5' 3'

Syntéza DNA: DNA-polymerasa enzym připojuje nukleotidy na 3'-konec rostoucího řetězce DNA vznik fosfodiesterové vazby mezi 3'-OH skupinou řetězce a 5'-fosfátovou skupinou přidávaného nukleotidu. Nukleotidy vstupují do reakce jako energeticky bohaté deoxynukleosidtrifosfáty (např. dATP) – dodání energie polymerizační reakci. DNA-polymerasa I vyplňuje vzniklé mezery v řetězci DNA; opravovač chyb v párování bází v DNA (3'→5' exonukleasová aktivita, hydrolyzuje DNA od 3'-konce); odbourává primery (5'→3' exonukleasová aktivita, hydrolyzuje DNA od 5 '-konce). DNA-polymerasa III syntetizuje DNA; opravovač chyb v párování bází v DNA (3'→5' exonukleasová aktivita, hydrolyzuje DNA od 3'-konce). Většinu nové DNA polymerizuje DNA-polymerasa III. DNA je syntetizována ve směru 5' → 3'.

Deoxynukleosidtrifosfáty DNA-polymerasa 3' Spustit animaci 5' Primer Vedoucí řetězec 5' 3' 3' Animaci spustíte kliknutím na tlačítko „Spustit animaci“. Deoxynukleosidtrifosfáty (na obrázku znázorněny zeleně) jsou pomocí enzymu DNA-polymerasy připojovány k vedoucímu řetězci (znázorněn oranžově). Deoxynukleosidtrifosfáty (dATP, dGTP, dTTP a dCTP) Enzym: DNA-polymerasa III 5'

Syntéza DNA: Primasa DNA-polymerasa neumí začít syntetizovat nové vlákno. Primasa – enzym, dokáže spojit dva volné nukleotidy. Primasa syntetizuje krátké úseky RNA (cca 10 nukleotidů). Snímky č. 16 – 17 týkající se enzymu primasy je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Při syntéze vedoucího řetězce je třeba pouze jeden RNA-primer. Syntéza opožďujícího se řetězce je však diskontinuální a vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. Tyto úseky poskytují 3'-konec pro DNA-polymerasu. Slouží tedy jako primer pro syntézu DNA.

Primasa Enzym: Primasa Primer 5' 5' 3' 3' Enzym: DNA-polymerasa 5'

Asymetričnost replikační vidličky První řetězec je syntetizován podle templátu ve směru 3'→ 5' (Vzniká 5'→ 3' řetězec) Druhý řetězec je syntetizován podle templátu ve směru 5'→ 3' (Vzniká 3'→ 5' řetězec). 3' 5' 5' 3' Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. 5' Směr replikace 3' 3' 5'

Asymetričnost replikační vidličky: Okazakiho fragmenty DNA-polymerasa syntetizuje nové vlákno pouze prodlužováním 3'-konce DNA (nový řetězec může vznikat jen ve směru 5'→3', neboli dle templátu 3'→5'). Je-li DNA syntetizována dle templátu 5'→ 3': - replikace probíhá diskontinuálně a „po zpátku“ syntetizují se tzv. Okazakiho fragmenty Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Obrázek znázorňuje antiparalelnost dvouřetězcové DNA. 5' 3' 3' Směr replikace 5'

Asymetričnost replikační vidličky: vedoucí a váznoucí řetězec 3' vedoucí řetězec 5' 5' 3' 3' 5' Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. „Po zpátku“ 3' opožďující se (váznoucí řetězec)

Asymetričnost replikační vidličky 3' 5' Vedoucí řetězec Váznoucí řetězec 5' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' Okazakiho fragmenty 5' 5' 3' Směr pohybu replikační vidličky Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. 5' 3' nejnověji nasyntetizovaná DNA

Váznoucí řetězec (I. část animace) 3' Vedoucí řetězec Spustit animaci 1. Primasa 2. DNA-polymerasa III 5' 5' 3' Snímky č. 16 – 17 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Animace se spustí po kliknutí na tlačítko „Spustit animaci“. Animace zobrazuje replikaci na váznoucím řetězci. Enzym primasa nejprve nasyntetizuje krátké úseky RNA (přibližně 10 nukleotidů dlouhé), poté enzym DNA-polymerasa III připojuje k těmto primerům správné deoxynukleosidtrifosfáty (dATP, dCTP, dGTP a dTTP). Pro syntézu vedoucího řetězce je třeba pouze jeden primer, kdežto syntéza váznoucího řetězce vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. Okazakiho fragmenty 3' Váznoucí řetězec 5'

Váznoucí řetězec Opožďující řetězec je tvořen mnoha oddělenými úseky tzv. Okazakiho fragmenty (cca 1000-2000 nukleotidů). Na vytvoření souvislého vlákna DNA z Okazakiho fragmentů jsou třeba tři enzymy: Snímky č. 18 – 19 týkající se Okazakiho fragmentů je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. 1. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) – odstraňuje RNA primery; 2. DNA-polymerasa I – nahrazuje RNA-primery DNA; 3. DNA-ligasa – spojí všechny úseky dohromady.

Váznoucí řetězec (II. část animace) 3' Vedoucí řetězec Spustit animaci 3. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) 5' 4. DNA-polymerasa I 5' 3' 5. DNA-ligasa Snímky č. 18 – 19 týkající se Okazakiho fragmentů je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Animace se spustí po kliknutí na tlačítko Spustit animaci. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) odstraňuje RNA-primery (na snímku jsou RNA-primery znázorněny fialově). DNA-polymerasa I tyto primery nahradí DNA. DNA-ligasa spojí 5'-fosfátový konec prvního úseku s 3'-hydroxylovým koncem druhého úseku (znázorněno zelenou vazbou). 3' Váznoucí řetězec 5'

Replikační aparát Vedoucí řetězec 5' 3' Vedoucí řetězec Svírací protein DNA-polymerasa Nově syntetizovaný řetězec Rodičovská DNA 3' 5' Primasa Nový Okazakiho fragment DNA-helikasa RNA-primer Jeden z možných modelů replikační vidličky. Předpokládá se však, že obě dvě DNA-polymerasy pracují jako multimerní komplex, tzn. že váznoucí řetězec je stočen tak, aby DNA-polymerasy mohly být v kontaktu. Vazebný protein pro udržení jednořetězcové struktury 3' 5' Váznoucí řetězec Okazakiho fragment

Replikace je proces semikonzervativní 5' 3' 3' 5' Replikace DNA je semikonzervativní, protože výsledkem replikace jsou dvě dceřinné dvoušroubovice, z nichž každá má jedno vlákno původní (mateřské – znázorněno oranžově) a jedno nově nasyntetizované (znázorněno modře a zeleně). 3' 5' 5' 3'

Korektorská schopnost DNA-polymerasy DNA-polymerasa katalyzuje reakci: (DNA)n + dNTP ⇄ (DNA)n + 1 + difosfát DNA-polymerasa je schopna hydrolyzovat DNA od 3'-konce (tzv. 3'→5' exonukleasová aktivita). Připojí-li se chybný nukleotid, vznikne nestabilní produkt, čímž dojde k posunutí rovnováhy ve směru výchozích látek. Snímek lze z učiva středoškolské biochemie vynechat. difosfát = P2O74- (PPi) DNA-polymerasa je velice přesně párující enzym: udělá průměrně 1 chybu na 107 zreplikovaných párů bází.

Použitá literatura ALBERTS, B. a kol. Základy buněčné biologie. Ústí nad Labem: Espero Publishing, 1997. NEČAS, O. a kol. Obecná biologie pro lékařské fakulty. Jinočany: Nakladateství H&H, 2000. KUBIŠTA, V. Buněčné základy životních dějů. Praha: Scientia, 1998. Obrázky: Milada Teplá (v MS powerpoint)