Imunologická diagnostika Anti-infekční imunita - bakteriální, virová, mykotická onemocnění Sledování imunitní odpovědi (imunitní stav organizmu, imunopatologie) Hypersensitivní reakce (alergie) Imunodeficity Autoimunitní onemocnění Onkologická hemagologická onemocnění Protinádorová imunita Základní přístupy: Co nejvyšší stupeň automatizace: analyzátory – protilátky, antigeny Moderní sofistikované metody: průtoková cytometrie Funkční testy lymfocytů: obtížně automatizovatelné

Laboratorní diagnostika v imunologii - hlavní metody Stanovení sérových komponent a protilátek - imunochemické metody Diagnostika autoprotilátek - fluorescenční metody Typizace imunokompetentních buněk - průtoková cytometrie Funkční testy imunokompetentních buněk - průtoková cytometrie

Zastoupení jednotlivých metod

Rutinní laboratoř Ústavu imunologie FN Motol Celkově 2011 2012 2013 Počet RČ 19 998 21 218 20 975 Celkový počet vyš. 255 638 250 766 240 129 Počet pacientů 36 641 36794 34 143 Počet vyš. za 1 den 700 729 668 Počet vyš. u 1 pac. 6,97 6 ,81 7,03  

Precipitační imunochemické metody Reakce založené na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem. Koncentrace příslušného antigenu je úměrná rychlosti tvorby nebo hustotě zákalu. Detekce s využitím rozptylu světla Rozptyl světla je soubor jevů, které způsobují, že disperzní soustava se při průchodu světla jeví zakalená. Při průchodu světla soustavou s disperzními částicemi se světelné paprsky mohou od částic odrážet Stanovení bílkovin séra na analyzátorech – turbidimetrie, nefelometrie

Turbidimetrie a nefelometrie Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném poměru s odpovídající protilátkou, vytvoří se precipitát. Kvantitativně byla tato reakce popsána již v r. 1929 Heidelbergem a Kendallem Po průchodu světelného paprsku suspensí imunitních komplexů dochází k poklesu jeho intenzity v důsledku rozptylu, absorpce a odrazu. Pokles intenzity paprsku je úměrný množství imunitních komplexů v roztoku.

Turbidimetrie a nefelometrie

Turbidimetrie a nefelometrie Optická metoda spočívající na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích (zákalu) Stupeň zákalu – turbidita Sleduje se pokles intenzity záření procházejícího absorbující a rozptylující vrstvou. Největší citlivost turbidimetrických metod se dosahuje modrým světlem (435-480 nm) Nefelometrie Je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu Úhel rozptylu je dán velikostí částic a vlnovou délkou dopadajícího světla Měření kinetické, měření rychlosti změny rozptylu světla, která je přímo úměrná rychlosti vzniku IK – Ag-Ab O řád citlivější než turbidimetrie (µg/ml)

Praktické aplikace IgA, IgG, IgM, IgD, podtřídy volné řetězce kappa, lambda reaktanty akutní fáze (CRP, haptoglobin, orosomukoid, ceruloplasmin, alfa 1 antitrypsin, alfa 2 makroglobulin) koagulační faktory, složky komplementu Léky (např. antibiotika) Finanční nákladnost – cca 100.-Kč/vzorek Příklady analyzátorů – Beckman, Olympus

Neprecipitační imunochemické metody používané v imunologické laboratorní diagnostice Základní princip = rekce antigen-protilátka označení Ag nebo Ab značkou Enzym Fluorochrom Luminofor Radioaktivní zářič

Citlivost kvantitativního stanovení antigenu/protilátky: precipitace - 30 mg/ml aglutinace - 1 mg/ml Neprecipitační imunochemické metody: RIA, FIA, LIA, EIA - 1 pg/ml 11

Rozdělení metod podle použitého značení Radioaktivní Enzymatické Fluorescenční Luminiscenční 12

Enzymová Immunoassay (EIA) Označení antigenu nebo protilátky enzymem Nejpoužívanější: křenová peroxidáza (HRP) alkalická fosfatáza (AP) Chromogenní substráty - barevný produkt - kolorimetrická detekce - spektrofotometrie HRP: tetramethylbenzidin (TMB) nebo o- fenylendiamin AP: 4-nitrofenylfosfát

Heterogenní enzymová assay – ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Dnes nejběžnější typ imunoanalýzy v imunologických laboratořích Antigen nebo protilátka jsou imobilizovány na pevný povrch – plastové mikrotitrační destičky Stanovení koncentrace antigenů nebo protilátek přímá úměra mezi koncentrací analytu a aktivitou enzymu

Sandvich ELISA Standardní ELISA na zjištění koncentrace antigenu navázání protilátky na pevnou fázi (polystyrén) přidání vzorku a inkubace – dochází ke vzniku vazby antigen- protilátka odmytí nenavázaného antigenu přidání druhé protilátky, vážící stejný antigen, na které je kovalentně navázán enzym inkubace a odmytí nadbytečné protilátky s enzymem přidání substrátu a průběh enzymem katalyzované reakce – barevný produkt

Capture ELISA Modifikace na detekci protilátek ve vzorku v 1. kroku navázán na pevnou fázi antigen druhá protilátka je namířena proti hledané protilátce (např. anti-Human IgG)

Výsledky imunoanalýzy kvalitativní Jediný kalibrační bod („cutoff“ bod) Výsledky jsou buď ‘pozitivní’ nebo ‘negativní’; (tj. nad nebo pod hodnotou cutoff) kvantitativní Vztah mezi naměřenou hodnotou a koncentrací zkoumané látky určen z kalibrační křivky (obvykle 5 – 6 bodů)

Využití ELISA metod Imunologický výzkum humánní i veterinární diagnostika Příklady : HIV-1 and HIV-2 (přítomnost anti-HIV protilátek) hepatitis C, B (přítomnost Ab i Ag) hormony (HCG, LH, TSH, T3 atd) stanovení protilátek po očkování (tetanus, dětské nemoci) cytokiny (interleukiny, TNF, EPO,atd.) alergeny autoprotilátky (RF, ENA, ANA) toxiny drogy

LIA (CLIA) ChemiLumminiscence Immuno Assay Chemiluminiscence se liší od ostatních luminiscenčních jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po přidání syntetizovaného činidla, nebo se k aktivaci činidel využívá oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence) luminiscenční značka – chemiluminofor luminol, izoluminol (aktivace přidáním H2O2) luciferáza - luciferin citlivost je vyšší než u RIA (záblesky světla - detekce světla)

FLUORESCENČNÍ METODY Reakce Ag-Ab, detekce antigenů Protilátka je označená fluorochromem Možnost použití více protilátek s různými fluorochromy Detekce fluorescenčním mikroskopem (tkáně) Detekce průtokovou cytometrií (suspenze buněk)

Metody detekce autoprotilátek Fluorescenční mikroskopické metody (nepřímá fluorescence) ANA, AMA, SMA, ScMA, GPC, LKM, ANCA, EMA, AECA, dsDNA, GBM ELISA - vyšetření např. ENA- screen, ENA-typizace, kardiolipin, RF, gliadin, transglutamináza, ANCA

Průtoková cytometrie Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie

Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“ Průtoková cytometrie je technologie, která umožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky Detekce & Počítání Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence Nevýhoda oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován Odpad Vzorek

Části průtokového cytometru Fluidika: vzorek – buněčná suspenze. Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření. Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry) Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu. Analýza dat: Zobrazení dat & analýza identifikace populací kvantifikace intenzity značení kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci

Schéma fluidiky (Variabilní) (Stálý) Unášecí tekutina Odpad Natlakování Vakuum Tlak Vzorku (Variabilní) Tlak unáš. tek. (Stálý) vzorek

Hydrodynamická fokusace Proud buněk (sample stream) je unášen obalem hnací kapaliny (sheath fluid) Zajišťuje se tak zúžení vzorkového proudu do tenkého paprsku, buňky se řadí jednotlivě za sebou. Buňky v tenkém paprsku protínají laserový svazek a vzniká pulz.

Princip průtokové cytometrie Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta Nasátí buněk Quartz nozzle Fluorescenční signály Laserový paprsek Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm - na některých přístrojích lze měnit

Rozptyl světla buňkou: Forward Scatter (FSC) Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla FSC závisí na velikosti buňky Laserový paprsek FSC Detektor

Rozptyl světla buňkou: Side Scatter (SSC) Laserový paprsek FSC Detektor Sběrné čočky Intenzita SSC je proporcionální množství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.) SSC závisí na granularitě buňky SSC Detektor

Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC Lymfocyty Granulocyty Monocyty Erytrocyty debris, Mrtvé buňky

Detekce fluorescence, značení protilátkami

Typizace buněk – CD znaky molekuly na povrchu krevních buněk fenotypizace leukocytů Číslovány podle mezinárodní CD nomenklatury od r. 1982 CD = cluster of differentiation Dnes známo 363 antigenů

Detekce Fluorescence Laser Beam Fluorescence Detector A, B, C, etc… FSC Detector Collection Lens Emitovaná fluorescence je pomocí sestavy filtrů a čoček rozdělena podle vlnové délky do kanálů. Na koncových detektorech je v každém z nich vyhodnocena intenzita fluorescence. Fluorescence Detector A, B, C, etc…

Základní konstrukce cytometru. Buňky v suspenzi s navázanou protilátkou(ami) prochází svazkem(y) laseru(ů) jedna po druhé. Měří se rozptyl světla v kolmém (SSC) a rovnoběžném (FSC) směru. Dále fluorescence v kolmém směru. Pro každou částici je zachycen a dále zpracován pulz rozptylu i fluorescencí ve všech sledovaných kanálech.

Relative fluorescence intensity Intenzita fluorescence FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Number of Events FITC FITC 101 102 103 104 Relative fluorescence intensity 6

Vícebarevná průtoková cytometrie FACS Aria

Vícebarevná průtoková cytometrie FITC PE APC PC7 PC5 Pacific blue

Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser) Stejná excitace různá emise Překryv spekter (overlap)

Mnohobarevná cytometrie Výhody Šetří čas a vzorky (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek Exponenciální nárůst informace Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%) interní kontroly ve vzorku Problémy Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách Vyšší možnost vzniku chyb Je potřeba zvolit správné kontroly

Analýza a interpretace dat Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního softwaru grafické zobrazení Různé typy grafů Statistiky Názvy běžných programů (CellQuest, DiVA, Flowjo, WinMDI, FCS Express)

Histogram – zobrazení jednoho parametru LIST MODE FILE Event # Param 1 FSC Param2 SSC Param 3 FITC Param 4 PE Param 5 APC 1 100 500 10 650 4 2 110 505 700 6 3 90 480 720 670 95 490 15 0………10………100………1000…….10000 Četnost (count) Intenzita signálu

Dot plot – zobrazení dvou parametrů Periferní krev – populace dle velikosti a granularity SSC FSC 30% Periferní krev – populace lymfocytů dle CD4 a CD8 60%

Gatování Populace krevních dendritických buněk Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají: procento pozitivních buněk Hodnota fluorescence (relativní hodnota) Gate je definován jako oblast Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subset buněk

Hlavní aplikace na průtokovém cytometru: Fenotypizace (zastoupení populací, testování aktivace buněk) Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk) Analýza proliferace (CFSE) Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické funkce) DNA a RNA analýza Sorting a buněčná izolace

Stanovení zastoupení základních buněčných populací Periferní krev CD4+ Th lymfocyty CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty CD16+CD56+ NK buňky CD19+ B lymfocyty

Analýza životnosti, apoptózy Apoptóza – fosfatidylserin na vnější straně membrány – vazba Annexinu V Mrtvé buňky Průnik barvy do jádra (PI nebo DAPI)

Oxidační reakce Superoxide Hydroethidine Např. Testování funkce makrofágů Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky. Superoxide Hydroethidine Hydrogen Peroxide Dichlorofluorescein Glutathione levels Monobromobimane Nitric Oxide Dichlorofluorescein

Testování fagocytózy Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ? Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR FITC (zelená) Control 0°C 4 hod 24 hod