Centrální dogma molekulární biologie Alexandr Sember

Genetika (2009) český překlad originálu Principles of Genetics 5th edition (Snustad a Simmons, 2009) Molecular Biology of the Gene 6th edition (2008) J. D. Watson et al.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4.TOC&depth=2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4.TOC&depth=2

cca. 15% celkové hmotnosti buňky (55% sušiny) tvoří proteiny Složení buňky 70% voda 30% ostatní malé mol. ionty 4% fosfolip. 2% DNA 1% RNA 6% proteiny 15% polysach. 2% nukleové kys. cca. 15% celkové hmotnosti buňky (55% sušiny) tvoří proteiny Buňka má informaci o syntéze proteinů uloženou v DNA

Centrální dogma MB Francis Crick (1956) Směr přenosu genetické informace: chromozomální DNA funguje jako templát pro RNA, která se poté přemístí do cytoplasmy, kde funguje jako templát pro proteosyntézu základní myšlenka stále platná, pouze později doplněna o možnost reverzní transkripce (Temin, Baltimore, 1970 – objevení reverzní transkriptázy u viru Rousova sarkomu, 1975 NC); pochopitelně je i možné přepsat RNA do další RNA

DNA jako genetický materiál 1868 – Johann Friedrich Miescher Izolace nukleinu z buněčných jader obvazy z gangrén nasáklé hnisem (leukocyty) Hrubé extrakty DNA (několik desítek bp) Unikátní poměr P/N, chybí S 1869 – 1940 – Phoebus Aaron Theodor Levene - pracoval na složení NK zjistil, že DNA má 4 základní kameny (báze) Naměřil,že jejich poměr je 1:1:1:1 tetranukleotidová hypotéza – pořadí nukleotidů je neměnné, tetranukleotid se pravidelně opakuje, proto nemůže vyjadřovat žádnou genetickou informaci; NK je lešení, na němž jsou navěšené proteiny; chemickou podstatu genu je třeba hledat ve struktuře proteinů

DNA jako genetický materiál 1928 – Frederick Griffith - pokus se Streptococcus pneumoniae (zápaly plic u člověka; smrt u myší) - nebezpečnost souvisí s obalením do polysacharidového pouzdra S-kmen - aktivní gen, který kóduje enzym pro syntézu kapsulárního polysacharidu - hladký vzhled (S = smooth, hladký) R-kmen (R= rough, drsný vzhled), nemají pouzdro a nejsou proto virulentní

DNA jako genetický materiál Griffithův experiment – došlo k přenosu genetického materiálu mezi dvěma kmeny bakterií procesem transformace 1. virulentní S - kmen způsobí smrt myši; 2. nevirulentní R – kmen, myš přežije; 3. – mrtvé virulentní kmeny – nic se neděje; 4. – mrtvé virulentní kmeny smíchané s živými nevirulentními → myš zemřela; izolace živých virulentních kmenů

DNA jako genetický materiál 1944 – Avery, McLeod, McCarty Transformační princip – komponenta mrtvé bakterie zodpovědné za transformaci Opakování Griffithova experimentu Využití rozkvětu enzymologie (proteázy, RNázy, DNázy) Pouze při působení DNáz experiment přestal fungovat Definitivní důkaz - DNA = gen. materiál 1941 – William Atsbury jako první izoloval opravdu vysokomolekulární DNA první difrakční obrazce 1950 Erwin Chargaff množství všech 4 bází není ekvimolární relativní podíl bází není náhodný (A=T, C=G) AT se nerovná GC, zastoupení u různých organismů se liší = vyvrácení tetranukleotidové hypotézy Chargaffovo pravidlo: poměr pur/pyr se rovná vždy 1 nezávisle na tom, z jakého zdroje DNA pochází

DNA jako genetický materiál Chargaffovo pravidlo: obsah pyrimidinů = obsah purinů

DNA jako genetický materiál 1952 – Alfred Day Hershey, Martha Chase (NC) Je DNA genetickým materiálem i u virů? analýza různých složek bakteriofága T2 využití pokroku (radioizotopy, izolace fágů, mikrobiologie E. coli) Kapsidy fágů zůstávají na povrchu x genetický materiál jde do bakterie

kultura E. coli s bakteriofágy → kultivace na médiu s radioaktivním P+S S → chybí v DNA P → chybí v proteinech (výjimky: fosforylace) 2 experimenty – v jednom případě značena pouze DNA a ve druhém pouze proteiny značené proteiny virového obalu zůstaly mimo buňku značená DNA viru se dostávala do buňky + vznik nového fágového potomstva definitivní důkaz, že za přenos dědičné informace je zodpovědná DNA i u virů RNA jako genetický materiál byla objevena roku 1957 u viru tabákové mozaiky TMV (Fraenkel-Conrat + Singer)

Rentgenová difrakční analýza William Atsbury, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin Rentgenová difrakční analýza – molekuly měřené struktury dokážou vychýlit rentgenový paprsek v závislosti na struktuře a molekulární hmotnosti (typu atomů) 1951 – Rosalind Franklinová – nejlepší difrakční obrazce

1414 1953 – James Watson, Francis Crick trojrozměrný model struktury DNA Syntéza z cizích výsledků (Franklin, Chargaff..) Důležitý ne přímo ten model, ale hlavně návrh, jak by se DNA mohla replikovat!! 1962 Nobelova cena za fyziologii a lékařství (spolu s Wilkinsem, ale bez Franklinové – zemřela ve 37 letech na rakovinu vaječníků, NC se neuděluje in memoriam)

kříž = šroubovice chybějící 4. řada pruhů ukazuje, že DNA je double helix Báze vrstveny kolmo k ose Vzdálenost mezi bázemi = 3,4 Å 1 otočka = 34 Å = 10 bp (ve skutečnosti 10,4) Průměr šroubovice = 20 nm 1 nm = 10-9 metru 1 Ångström (Å) = 0,1 nm

Struktura NK Primární struktura = posloupnost nukleosidtrifosfátů (NTP, dNTP) pospojovaných fosfodiesterovou vazbou (resp. pořadí bází);Nevětvené lineární molekuly Nukleotid v se skládá z: 1) Sacharidová jednotka (cukr, furanóza) DNA: 2-deoxy-β-D-ribóza RNA: β-D-ribóza   2) Dusíkatá baze – adenin, guanin, thymin, cytosin, uracil Purinové baze: A, G Pyrimidinové baze: C, T, U 3) Zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné Nukleotid = nukleosid (cukr+báze) + fosfát

Struktura NK Nukleotid v se skládá z: 1) Sacharidová jednotka (cukr, furanóza) DNA: 2-deoxy-β-D-ribóza RNA: β-D-ribóza   2) Dusíkatá baze – adenin, guanin, thymin, cytosin, uracil Purinové baze: A, G Pyrimidinové baze: C, T, U 3) Zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné N-glykosidická vazba Pozice na cukru se označují tzv. „s čarou“ (na bázích ne) Největší rozdíl mezi DNA a RNA je 2´OH skupina RNA

Struktura NK Nukleotidy: adenosin guanosin thymidin mono-di-tri -fosfát cytidin uridin AMP – ADP – ATP dATP x ATP  

Struktura NK Puriny: aromatické heterocyklické báze, rovinný (= planární) dvojcyklus, v poloze 9 je navázán cukr Adenin = 6-aminopurin (analog je mutagenní 2-aminopurin) Guanin = 2-amino-6-ketopurin

Struktura NK Pyrimidiny: aromat. heterocykly, jednoduchý cyklus, v poloze 1 je navázán cukr Cytosin = 2-keto- 4-aminopyrimidin (O= na C2 a NH2 na C4) Thymin = 2,4 – diketo – 5 – metylpyrimidin (O =na C2 a C4, metyl na C5) Uracil = 2,4 – diketopyrimidin (O= na C2 a C4) Thymin je vlastně 5-metyluracil Deaminací cytosinu vzniká uracil Deaminací 5-metylcytosinu vzniká thymin Zapamatujte si uracil a máte vyhráno

Tautomerismus bází Přeskakování vodíku mění uspořádání donor/akceptor vodíkové vazby – jiné preference párování Stabilní formy bází = keto (T, G, U), amino (A, C) Méně stabilní izoformy = enol (T, G, U), imino (A, C)

Nukleotidy mohou mít i jiné funkce… Zdroj metylu pro metylace Nukleotidy mohou mít i jiné funkce… ATP = zdroj energie v živých systémech Kofaktory enzymů Kofaktor enzymů Druzí poslové v signalizaci

G-C 3 vodíkové vazby Sekundární struktura DNA = 2 molekuly ssDNA spojené vodíkovými vazbami (Watson-Crickovské párování bází) Báze jsou komplementární (donor/akceptor vodíkové vazby) A-T 2 vodíkové vazby G-C 3 vodíkové vazby Páry AT a GC jsou stejně široké (překryv C1 deoxyribózy = N-glykosidická vazba, symetrie helixu) Vodíková vazba = interakce mezi silně elektronegativním atomem (O, F, N) a vodíkem NH2 = donor H-vazby =O, N = akceptor H-vazby

28 typů párování nukleotidů volně v roztoku př. Hoogsteenovo párování – rekombinace, G-kvartet; wobble párování – využití při čtení genetického kódu

2525 Polarita řetězců dána fosfodiesterovou vazbou 5´ ATTGCCA 3´ 3´ TAACGGT 5´ 5´-P a 3´OH Watson-Crickovské párování Antiparalelní uspořádání Pravotočivá dvojšroubovice Báze jsou uvnitř, cukr-fosfátová kostra vně Malý a velký žlábek Sekundární struktura DNA = pravotočivá/levotočivá dvojšroubovice Terciální struktura DNA= lineární, kružnicová, nadšroubovice Kvarterní struktura DNA = pouze ve smyslu nějakého komplexu s proteiny

Malý a velký žlábek 2626 Důvody: páry bází neprocházejí přesně středem podélné osy dvoušroubovice N-glykosidické vazby nevycházející z páru bází pod úhlem 180°. Úhly mezi oběma vazbami jsou 120° (malý žlábek) a 270° (velký žlábek) 270° Důsledek: Jiná nabídka chemických skupin v malém žlábku chybí metyl – rozpoznání pouze páru AT nebo GC Ve velkém žlábku rozpoznání konkrétní báze (využití regulačními proteiny, regulace transkripce x TBP vazba do malého žlábku) 120°

Stabilita DNA 1) Stacking interakce 2) Hydratační obal hlavní příspěvek ke stabilitě DNA Vrstvení bází na sebe (hydrofobní a van der Waalsovy interakce) splývání oblastí výskytu delokalizovaných π-elektronů sousedících aromatických kruhů GC páry mají mnohonásobně silnější stacking interakce mezi sebou (než AT páry) 2) Hydratační obal Primární (pouze voda) a sekundární (+ ionty) Primární obal: 20 molekul vody / 1 nt Zeslabení odpuzování sousedních fosfátů Hydrofobní interakce (posiluje stacking) Doplnění dalších vodíkových můstků 3) Vodíkové vazby mezi bázemi Velmi malý příspěvek ke stabilitě Význam spíše pro specifitu párování

Konformace DNA/RNA 2828 Konformační polymorfismus Různá hydratace a koncentrace solí Modifikace bází (př. 5-metylcytosin u Eukaryot) Alternativní párování bází, vrtulovité zkroucení bází apod. Konformační flexibilita ribózy a N-glykosidické vazby Sekvenční polymorfismus – závislost struktury na lokální sekvenci

3D struktura molekuly: Popis torzními (dihedrálními) úhly – jejich součet = 180° 0° = syn 180° = anti Máme atomy ABCD, které jdou ve vazbách za sebou; torzní úhel je úhel mezi vazbami AB a CD podle vazby BC, která tvoří jakoby pant mezi nimi

N – glykosidická vazba Konformace ribózy Všechny nukleotidy preferují anti Pouze G preferuje aspoň z 15% syn Konformace ribózy Pokud jsou C4, O4 a C1 v jedné rovině, sledujeme, co je nad a pod rovinou cyklu V DNA obvykle C2-endo, fosfáty pohodlně daleko od sebe (70 Å) V RNA a hybridech DNA/RNA obvykle C3 – endo (kvůli 2´OH skupině)

Konformace DNA/RNA Ribóza ve C3-endo C2-endo, klasická forma DNA RNA, hybrid DNA/RNA Báze vytlačeny od středu, uprostřed kanál C2-endo, klasická forma DNA Žlábky pěkně vykreslené C2-endo, G v syn Schodovitá struktura, opakování dvou párů bází Levotočivá!!

Elektrické vlastnosti NK záporný náboj, pohyb v elektrickém poli chovají se jako polyanionty (dsDNA má dva mínus náboje/1bp) separace na agarózovém nebo PAA gelu = elektroforéza (anionty jako např. NK jdou k kladné elektrodě, tedy k anodě), vizualizace např. ethidiumbromidem (interkalační činidlo) dělení podle velikosti a topologie, menší molekuly procházejí rychleji

Denaturace NK Reverzibilní narozdíl od proteinů Denaturace teplotou, pH (pod 3, nad 11), formamidem (interference H-můstků), močovinou, enzymaticky (helikáza) Denaturace a reasociace (repetitivní sekvence rychleji) Stabilita duplexů klesá v řadě RNA/RNA DNA/RNA DNA/DNA Tání duplexů lze sledovat pomocí měření absorbance v UV-oblasti NK mají absorpční maximum při vlnové délce 260 nm, proteiny při 280 nm Tm = teplota tání = teplota, při které je polovina duplexu denaturována; je tím vyšší, čím je větší obsah GC Hyperchromní efekt = zvýšení absorbance i přesto, že koncentrace DNA se nemění (při denaturaci volné báze lépe absorbují UV) dsDNA má absorbanci o 40% menší než dvě ssDNA

Hybridizace denaturac e hybridizac e cílová DNA sonda FISH = Fluorescence in situ hybridization X Southern, Northern blot = hybridizace in vitro

Rozdílné vlastnosti DNA/RNA v extrémním pH Silně kyselé pH DNA: bude snáze docházet k depurinacím, DNA zdenaturuje, ale i zdegraduje RNA: pouze zdenaturuje (stabilní při pH 4 – 5,2) Silně zásadité pH DNA: bude pouze denaturovat RNA: deprotonace 2´OH skupiny – nukleofilní atak fosfodiesterové vazby– vznikne 2´- 3´cyklický fosfát - rozpad na směs 3´ +2´ monofosfátů = denaturace+degradace

Struktura RNA Vyšší flexibilita, strukturní a funkční mnohotvárnost Často ssRNA, menší velikost Rozmanité sekundární struktury (vlásenky, bubliny…) Terciální struktury (pseudozel..) 16S rRNA Stabilita: intramolekulární interakce (za přispění 2´OH a nekonvenčního párování pází), stacking interakce, vazba dvojmocných kationtů, stabilní tetraloops (rRNA), mnoho modifikovaných bází a případná metylace 2´OH, tautomerie bází

Využití 2°struktury (vlásenka, SECIS) k inkorporaci selenocysteinu do proteinu Využití 3°struktury (4 pseudouzly) k oddělení funkčních tRNA-like a mRNA-like domén ve struktuře tmRNA (záchrana ribozomu z aberantní mRNA u bakterií)

Funkce RNA Fce. RNA Typy RNA - Čtení genetického kódu -    Primery pro replikaci DNA -    Genom mnoha virů - Strukturní (ribozom, SRP…) -    Ribozymy (katalytická fce.) Riboswitch (metabolite-sensing) RNA interference (siRNA, miRNA, piRNA…) Typy RNA   1) mRNA 2) „udržovací“ (housekeeping) RNA - tRNA, rRNA, snRNA,snoRNA, telomerázová RNA, SRP RNA, RNasaP, RNAsa MRP, tmRNA… 3) regulační RNA miRNA (micro), siRNA (short interfering), piRNA (piwi interacting), riboswitch, sRNA 4)„parazitické“RNA (retrotranspozony, viroidy, virusoidy, RNA virů) 5) jiné RNA (guide RNA) Červeně: ribozymová aktivita (u snRNA a rRNA jen některé – U2+U6 snRNA, 23S rRNA)

RNA Tie Club (24 členů s kravatou báze nebo AMK) (foto: zleva Crick, Rich, Orgel, Watson) Adaptorová hypotéza: informace v DNA není převáděna do polypeptidu přímo vodíková vazba mezi nt+AMK je nepravděpodobná existuje tRNA = adaptorová molekula, která se kovalentně váže k AMK a nekovalentně k NK   Mimo klub: 1953 – Zámečník a kol. Užití cell-free extraktů, radioaktivně značených AMK a ultracentrifugy Objev rozpustné S (soluble) RNA (což byla tRNA) Na S-RNA se nejdříve váže AMK a až pak se AMK dostanou do proteinů

4040 Objev rRNA a mRNA (1960) rRNA (85% RNA v buňce), je v ribozomech = templát?? NE – uniformní délka + kompozice bází (GC-bohaté) u různých organismů objev mRNA na základě infekce E. coli fágem T4 fágová RNA má velmi podobnou kompozici bází jako fágová DNA RNA se neváže s ribozomálními proteiny za tvorby ribozomálních partikulí pohybuje se napříč povrchem ribozomu templát, který určuje pořadí AMK v proteinu variabilita v délce a kompozici bází

4141 Severo Ochoa – 1959 NC za syntézu RNA - polynukleotid fosforyláza (PNPáza) – in vivo u bakterií štěpí RNA na mononukleotidy, ale přidá k nim navíc ještě 1 fosfát – vznikají nukleosiddifosfáty 1. Kodon – Phe (Nierenberg, Matthaei, 1961; NC roku 1968) Užití PNPázy na syntézu poly -U templátu z nukleosiddifosfátů Translace in vitro z poly-U mRNA- produktem byl polyfenylalanin …pak CCC, AAA…(GGG nefungoval)

Genetický kód 4 báze a kód je tripletový = 3 báze kódují 1 aminolyselinu (AMK) = 43 kombinací = 64 kodonů, z toho 61 kóduje AMK, 3 stop kodony; kodon pro methionin je zároveň iniciační Degenerovaný kód = více různých kodonů kóduje stejnou AMK Univerzální = až na výjimky je stejný u všech organismů Nepřekryvný = báze 1,2,3 kódují 1AMK, báze 4,5,6 kódují další, není tam překryv

tRNA

Wobbling inosinu v antikodonu Modifikované báze Wobbling inosinu v antikodonu

Ribozymy – objev (80.léta, NC 1983) GI intron ve 26S rRNA Tetrahymena thermophila (Thomas Cech) Rnáza P – sestřihnutí 5´konce prekurzoru tRNA u E. coli (Sidney Altman)

Hammerhead ribozym u viroidů a virusoidů Ribozymy Ribozymy obecně často něco štěpí (s výjimkou např. ribozomu, který syntetizuje), štěpení probíhá v jednovláknové oblasti, obvykle je přímo či nepřímo zůčastněna 2´OH skupina, proteiny udržují správnou konformaci ribozymu, pro funkci je dále důležitá vazba kationtů Hammerhead ribozym u viroidů a virusoidů

Ribozymy

Riboswitch Centrální dogma MB Genetika - český překlad (2009) Principles of Genetics 5th edition (Snudtad, Simmons, 2009)

RNA svět Ribozymy a riboswitche – náznak, že původní svět mohl být založen na RNA DNA – stabilnější (bez 2´OH, T místo U) – přesun odpovědnosti za uložení genetické informace Proteiny – převzaly většinu katalytických rolí Chybí důkazy RNA světa (fosílie)

Děkuji za pozornost..