SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení detekce po izolaci a následné separaci proteinů - SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce F-aktinu, G-aktinu a DNA F-aktin: phalloidin konjugovaný s TRITC G-aktin: DNáza I konjugovaná s Alexa Fluor 488 DNA: DAPI použité buňky – buněčná linie NES2Y (lidské -buňky Langerhansových ostrůvků)

Fixace – první krok přípravy vzorku brání rozkladu a autolýze tkáně cíl - zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín) vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet tkáň se stává rigidnější (snazší manipulace)

Pracovní postup: fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS inkubace buněk s phalloidinem-TRITC a DNázou I-Alexa Fluor 488 odstranění nevázaného phalloidinu-TRITC a DNázy I-Alexa Fluor 488 pomocí opakovaného promytí v PBS barvení DNA pomocí DAPI pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

METODA 2: Porovnání zastoupení aktinu v různých typech tkání pomocí metody SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného) Izolace proteinů z různých typů tkání použité typy tkání: sval srdce játra

Izolace proteinů z tkáně: prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk dezintegrace (lýza) buněk působením: chemickým (používáme v našich experimentech) mechanickým fyzikálním

Pracovní postup: Izolace proteinů Stanovení koncentrace proteinů přenos tkáně do zkumavky dezintegrace buněk pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát) oddělení směsi proteinů od nezlyzované tkáně centrifugací Stanovení koncentrace proteinů pomocí metody podle Bradfordové použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu nezbytného pro vytvoření kalibrační křivky

Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícím SDS nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinů na polyakrylamidový gel separace proteinů pomocí vertikální elektroforézy Identifikace proteinů barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku Coomassie Brilliant blue lokalizace aktinu a ostatních proteinů v gelu, porovnání míry exprese v jednotlivých tkáních chemiluminiscenční detekce aktinu (pouze demonstrace)

Stanovení koncentrace proteinů používány různé metody všechny uvedené metody jsou založené na spektrofotometrickém stanovení (měření absorbance) metoda podle Bradfordové (námi použitá metoda) Lowryho metoda BCA metoda (Bicinchoninová metoda) stanovení z UV spektra, atd.

Stanovení koncentrace proteinů metodou podle Bradfordové příprava standardů pro sestavení kalibrační rovnice – několik vzorků proteinu o známé koncentraci (jako standard obvykle používán bovinní sérový albumin = BSA) naředění lyzátu (koncentrace v rozsahu kalibrační přímky) inkubace standardů a našich vzorků o neznámé koncentraci s činidlem Bradfordové změření absorbance (A595 nm) konstrukce kalibrační přímky zjištění koncentrace proteinů v lyzátu výpočtem z rovnice kalibrační křivky

Princip metody Bradfordové kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (arginin (ARG), fenylalanin (PHE), tryptofan (TRY) a prolin (PRO))

Coomassie Brilliant Blue po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou detekce při 595 nm

Kalibrační křivka

Lowryho metoda založená na detekci některých aminokyselin (tyrosin a tryptofan) modré zabarvení roztoku (v závislosti na zastoupení obou aminokyselin ve vzorku) je detekováno při 500-750 nm

Stanovení z UV spektra stanovení koncentrace proteinů pomocí absorpce v UV spektru (260 - 280 nm) závislé na přítomnosti aromatických aminokyselin v proteinech (tyrosin a tryptofan) [Protein] (mg/mL) = 1.55*A280 - 0.76*A260

BCA metoda BCA = bicinchoninic acid barevná reakce založena na interakci s peptidovou vazbou purpurové zbarvení detekovatelné při 562 nm