Epigenetika - metylace DNA

Metylace DNA u Eukaryot nemetylovaná DNA: kvasinka Saccharomyces cerevisiae, octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice Caenorhabditis savci: 3-8 % cytosinových zbytků, CG sekvence (u embryonálních kmenových buněk i v non-CG kontextu) - nízký výskyt CG v repetitivních heterochromatinových oblastech (mutageneze) rostliny: 25-30 % cytosinových zbytků (~ velikosti genomu) především v repetitivních heterochromatinových oblastech (pravidelný výskyt nemetylovaných míst – SAR, MAR) - u větších genomů (obiloviny) ostrovy transkripčně aktivní DNA s nižším obsahem metC metC (CG) je ale i v kódujících sekvencích exprimovaných genů!!!

Mechanismus metylace DNA - metylace bází - cytosinu a adeninu (bakterie – restrikce cizorodé DNA) u Eukaryot je biologicky významná metylace cytosinu na C5 purinového kruhu (u savců i hydroxymethylC) H H H H N N O H T CH3 thymine + H2O - NH3 „horký bod mutageneze“ N CH3 N C N C* + SAM O N O N cytosine 5-methyl cytosine

Metylace DNA – cílové sekvence - symetrické (palindromatické), polosymetrické i nesymetrické sekvence: 5’ -------CG-------CHG----------C---C------G--C---- 3’ 3’ -------GC-------GDC----------G---G------C--G---- 5’ (H = A, T nebo C; D = A,T,G) Symetrické sekvence – snadné udržování při replikaci hemimetylovaný stav je signálem pro udržovací metylaci ----C*G------------- C*HG---------- C* ------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG -------------CHG -----------C-------- -----GC* -------------GDC*-----------G-------- Asymetrické sekvence – nutno neustále metylovat de novo (principielně je ale také udržovací, pokud byla na mateřském vlákně) - signál: metylace histonů a sRNAs

Cílová místa metylace DNA v chromatinové struktuře/sekvenci Preferenční metylace exonů – souvislost s preferenčním výskytem nukleozómů na exonech (spoludefinování přechodu intron – exon a exon – intron) (současně zvýšený výskyt polymerázy II - zbrždění nukleozómem) - bránění inkorporaci H2A.Z Preferenční výskyt metC na vnější straně nukleozómů souvisí s preferenčním výskytem C-G na vnější straně (stérické důvody) lépe přístupný pro metyltransferázy

Předpokládaná korelace přítomnosti H2A.Z, metylace DNA a regulovatelnosti/míry exprese ( ) Coleman-Derr and Zilberman 2012 - metylace DNA brání inkorporaci H2A.Z - H2A.Z nevhodný/neumožňuje stabilní expresi (house-keeping genů)

Analýzy metylace DNA Přímé (strukturní): spektrofotometrie, HPLC (celkový stav) - %metC anti metC protilátky (na chromozómu …) - lokalizace metC bohatých úseků chromozómů pomocí restriktáz citlivých k metylaci - detekce metC v konkrétním restrikčním místě hydrogensiřičitanovým sekvenováním - přesné určení C a metC v určité sekvenci - i v celém genomu (v kombinaci s moderními technikami sekvenování) Nepřímé (funkční) – vztah mezi metylací a genovou expresí - např. sledování reaktivace umlčených genů

Analýzy metylace DNA pomocí restrikčních endonukleáz citlivých k metylaci - štěpení, Southernova hybridizace - PCR, elektroforéza (méně spolehlivé) (izolace krátkých na geny bohatých fragmentů u velkých genomů - kukuřice) A -----------C CGG-----------------------------------CmetCGG--------------------------C CGG---------------------- B -----------C CGG-----------------------------------C CGG--------------------------C CGG---------------------- - štěpení restriktázou citlivou k metylaci cílové sekvence PCR primer elektroforéza a Southern PCR a elektroforéza A B A B

Analýzy metylace DNA hydrogensiřitanová modifikace, shotgun sequencing nebo PCR + sekvenace 1. denaturace ---------C*---------C--------CC---C*------C------------C-- 2. modifikace Cyt na Ura (5metC zůstává nezměněn) ---------C*---------U--------UU---C*------U------------U-- 3. PCR, sekvenace (WGS) původní sekvence ---------C---------C-------- CC---C------C------------C-- ---------G---------G--------GG---G------G------------G-- modifikovaná sekvence ---------C---------U--------UU---C------U------------U-- ---------G---------A--------AA---G------A------------A--

Analýza metylace u Arabidopsis „Chromosome epigenetic landscape“ ? ?

Mutace zprostředkované metylací C C T metC G T G replikace reparace C G T A Možná role v evoluci genů: zdvojení sekvencí (např. po polyploidizaci) navodí metylaci metylace navodí reversibilní inaktivaci mutace metC může navodit irreversibilní inaktivaci kopie genu může být postupně masivně mutována (bez selekčního tlaku) - vznik a reaktivace genu s novou funkcí

Genom Arabidopsis - statistika Feature Value DNA molecule Chr.1 Chr.2 Chr.3 Chr.4 Chr.5 SUM Length (bp) Top arm (bp) Bottom arm (bp) Base composition (%GC) Overall Coding Non-coding Number of genes Gene density (kb per gene ) Average gene Average peptide Exons Number Total length (bp) Average per gene Average size (bp) With ESTs (%) Number of ESTs 29,105,111 14,449,213 14,655,898 33.4 44.0 32.4 6,543 4.0 2,078 446 35,482 8,772,559 5.4 247 60.8 30,522 19,646,945 3,607,091 16,039,854 35.5 32.9 4,036 4.9 1,949 421 19,631 5,100,288 259 56.9 14,989 23,172,617 13,590,268 9,582,349 35.4 44.3 33.0 5,220 4.5 1,925 424 26,570 6,654,507 5.1 250 59.8 20,732 17,549,867 3,052,108 14,497,759 44.1 32.8 3,825 4.6 2,138 448 20,073 5,150,883 5.2 256 61.4 16,605 25,53,409 11,132,192 14,803,217 34.5 32.5 5,874 4.4 1,974 429 31,226 7,571,013 5.3 242 22,885 115,409,949 25,498 132,982 33,249,250 105,773

Rostlinné cytosin 5-metyltransferázy - 3 rodiny u Arabidopsis MET1 (metyltransferase) CMT3 a CMT2 (chromomethyltransferase) DRM2 (a DRM1) (domain rearranged methyltransferase)

MET1 (metyltransferase1) - příbuzná savčí Dnmt1 - udržovací metylace symetrických CG - asociovaná s replikací spoluúčast komplexu remodulujícího nukleosómy DDM1 (u heterochromatinových sekvencí) Signál – hemimetylovaná CG sekvence ----C*G------------- C*HG---------- C* ------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG -------------CHG -----------C-------- -----GC* -------------GDC*-----------G--------

CMT3 (chromomethyltransferase3) - unikátní pro rostliny a houby (příbuzné savčím Dnmt1, ale navíc obsahují chromodoménu = doménu interagující s metK histonu - asociovaná především s konstitutivním heterochromatinem (repetitivní sekvence, TE - retrotranspozóny) „udržovací“ metylace sekvencí CHG zřejmě kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein) Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 - (interakce zprostředkovaná chromodoménou) ----C*G------------- C*HG---------- C* ------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG ------------- CHG -----------C-------- -----GC* -------------GDC*-----------G--------

CMT2 (chromomethyltransferase2) - příbuzná CMT3, rovněž obsahuje chromodoménu - asociovaná s konstitutivním heterochromatinem „udržovací“ metylace sekvencí CHH kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein) Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 – (interakce zprostředkovaná chromodoménou) ----C*G------------- C*HG---------- C* ------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G DC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG ------------- CHG -----------C-------- -----GC* -------------GDC*-----------G--------

DRM2 a 1 (domain rearranged methyltransferase) příbuzné savčím Dnmt3, ale mají přeskupené domény DRM1 – v časné fázi vývoje semen „udržovací metylace“ asymetrických sekvencí CHH (CHG) (euchromatin a okraje heterochromatinu) regulace genové exprese, silencing nutná spoluúčast katalyticky neaktivního paralogu DRM3 u Arabidopsis Cílové sekvence jsou určeny přítomností homologních siRNA = RNA-directed DNA Methylation (RdDM) ----C*G------------- C*HG---------- C* ------- ---------C*G ---- ---- G C------------ G HC-----------G ------- ---------G C*---- -----CG -------------CHG -----------C-------- -----GC* -------------GHC*-----------G--------

Udržovací metylace DNA Heterochromatin s histonem H1 - střední části dlouhých TE (kódující sekvence) - nutná účast chromatin remodel. faktoru DDM1 - metylace řízena: H3K9me2 – CMT2, CMT3 (CHH, CHG) metylací – MET1 (CG) Chromatin bez histonu H1 - okraje TE, krátké TE, geny - účast chromatin remodel. faktoru DRD1 - metylace řízena především siRNA (RdDM) – DRM2 (RdDM – iniciována na H3K9me2 a nemetyl. H3K4, viz dále u RNAi) (- metylace CG řízena metylací – MET1)

Udržovací metylace transpozónů Zemach et al. 2013

Demetylace DNA 1) při replikaci s vyloučením aktivity udržovacích cytosin metyltransferáz (a histonových metyláz) 2) DNA glykosylázy (odštěpení metylcytosinu, reparací doplněn cytosin) ROS1 REPRESSOR OF SILENCING – somatické buňky (k demetylaci nutný ROS3 – protein vázající RNA – sRNA ? mRNA) DEMETER-LIKE (DML2, DML3) – somatické buňky DME1 DEMETER – parentální imprinting (endosperm)

Demetylace DNA ROS1 REPRESSOR OF SILENCING DEMETER-LIKE (DML2, DML3) ros1 dml2 dml3 rel. nárůst metylace ROS1 REPRESSOR OF SILENCING DEMETER-LIKE (DML2, DML3) (částečně zastupitelné) aktivní ochrana reg. sekvencí genů (promotorů) před metylací (příp. při řízené modulaci transkripce) - mutace v „demetylačních“ genech se projeví především nárustem metylace v 3’ a 5’ UTR V metylačních (metyltransferázových) mutantech je demetylace utlumena (zpětná vazba). metylace WT WT

Ovlivňování metylace DNA - aplikace 5-azacytidinu – blokování aktivity MET1 - dihydroxypropyladenin (DHPA) – ovlivnění hladiny SAM - (inaktivace genů MET1, DDM1, CMT3, …) Projevy: - různé: žádné až výrazné změny fenotypu (způsobené TE) - pohlavní reverze u knotovky (andromonoecie), fenotyp cycloidea u lnice, …

Reaktivace umlčených transgenů 5-azacytidinem hemiMet? deMet - inhibitor MET1 (5-azacytidin, AzaC) + AzaC + AzaC Demethylated - obnovení často jen přechodné! Nocarová, Fischer, nepubl.

Stérické důsledky metylace DNA - buněčná interpretace metylace DNA změny na úrovni histonů - posttranslační modifikace histonů - SRA domény: metylace (SUVH family), - Metyl CpG-binding d.: deacetylace (HDAC) - zastoupení různých forem histonů (H2A.Z) změna vazby dalších interagujících proteinů - regulátorů (aktivátorů a represorů) transkripce - proteinů zodpovědných za strukturu/modifikace chromatinu

příklad: MBD proteiny (metyl-CpG-binding domain) - rostlinné MBD proteiny nemají TRD (transcription repression domain) - specifita vazby je dána i dalšími interagujícími proteiny - kolokalizace a interakce s DDM1 - AtMBD5 interaguje i s C*HH - MBD proteiny zřejmě interagují s histon modifikujícími proteiny (HDAC = histon deacetylázy) Model komprimace chromatinu vazbou dimerizujícího AtMBD7 proteinu

Autokatalytická smyčka - metylace CHG (CMT3) a metylace H3K9 (KYP, KRYPTONITE) - transkripce indukuje demetylaci H3K9me2 (IBM1) ROS1/ ROS3 ??? x DRM2 Obdobné snížení množství H3K9me2 u mutantů kyp a cmt3 „co je defaultní“ stav?

Metylace DNA a stav chromatinu - přehled - prokázána korelace hypermetylace DNA a hypoacetylace histonů (pozdní replikace DNA) - metylace DNA je dědičným signálem k deacetylaci histonů a kondenzaci chromatinu obdobné fenotypové změny při potlačení metylace (MET1) a deacetylace histonů (AtHD1) přítomnost formy histonu H2A.Z se vzájemně vylučuje s DNA metylací!!! (typicky v promotorech house-keeping genů)

Metylace DNA a stav chromatinu - di(tri-)metylace H3K9 (KYP) je signálem pro metylaci CHG - metylace CHG je signálem pro metylaci H3K9 k demetylaci H3K9 (IBM1) zřejmě dochází v souvislosti s transkripcí Pol II demetylace DNA prostřednictvím ROS1 vyžaduje RNA vazebný ROS3 (transkripce, malé RNA?) trimetylace H3K4 je typická pro euchromatin a vzniká v souvislosti s transkripcí Pol II (aktivní DNA)

Udržování epigenetického stavu – přehled Neaktivní chromatin - MET 1 – udržovací metylace C*G KYP (SUVH5,6) – H3K9me2  CMT3 - C*HG (CMT2 – C*HH) DRM2, (DRM1) – udrž. metylace CHH  komplement. siRNA Aktivní chromatin IBM1 – demetylace H3K9  transkripce ROS1/ROS3, DML2, DML3 – demetC  transkripce?, sRNA?

Vzájemná provázanost metylace DNA a struktury chromatinu metC = modifikace dvoušroubovice DNA post- translační modifikace a formy histonů vazba interagujících proteinů TF, RNA pol., MBD, …

Úloha a projevy metylace DNA dědičná (mitoticky a částečně i meioticky) modulace transkripce - genové exprese - obranný mechanismus vůči invazní DNA (transpozóny) - regulace genové exprese (ontogeneze, diferenciace a buněčná paměť, reakce na stres) - parentální imprinting modulace struktury chromatinu (příčina i následek) - časování DNA replikace - regulace homologní rekombinace (meiosa) - definování hranic exon-intron nástroj evoluce - genomů polyploidních rostlin (rozsáhlé změny metylace) - nových genů (mutageneze pseudogenů)

Metylace DNA u Arabidopsis Silná metylace v repetitivních heterochromatinových oblastech v okolí centromery Metylace v kódujících sekvencích genů – u více než 30 % exprimovaných genů (metylace především u genů se stabilní expresí – house keeping) Metylace v promotorech – u méně než 5 % genů (geny s vývojově a pletivově specifickou expresí)