Metody v histologii Mikroskop

Organizace praktických cvičení Příprava histologického preparátu Mikroskop Barvicí metody Práce s mikroskopem (preparáty)

Zobrazení živých buněk Jednobuněčné organismy Mnohobuněčné organismy: gamety, krvinky, buňky z tkáňových kultur Pozorování buď speciálním mikroskopem (fázový kontrast) nebo po barvení supravitálními barvivy

Odběr Odběr tkání a buněk: Ze živého organismu (BIOPSIE) Z mrtvoly (NEKROPSIE) Je nutno provést fixaci, jinak se tkáň vlivem vlastních enzymů a působením bakterií rozloží (AUTOLÝZA) Blok tkáně pro fixaci ve světelné mikroskopii nemá být větší než 1cm3

Fixace Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů. Fyzikální metody: Teplo (mikrovlnná trouba) Zmražení (tekutý dusík – 170 oC) Chemické metody: Imerzní (ponoření do fixační tekutiny) Perfuzní (nástřik cév)

Chemická fixace Aldehydy Formaldehyd, glutaraldehyd Alkoholy Methanol, ethanol Kyseliny Kyselina octová, trichloroctová, pikrová Soli těžkých kovů Chlorid rtuťnatý, oxid osmičelý,dvojchroman draselný

Fixační tekutiny Formaldehyd 4% Bouinova tekutina trinitrofenol, formol, kys.octová Susa chlorid rtuťnatý, chlorid sodný, kys.octová, kys.trichloroctová, formol Zenkerova tekutina chlorid rtuťnatý, dvojchroman draselný,síran sodný, kys. octová Carnoy ethanol, chloroform, kys.octová Methacarn Methanol, chloroform, kys.octová

Zalévání a krájení Pro krájení je nutno tkáň zpevnit zalitím do zalévacích médií (parafin, celloidin). Protože tato media nejsou mísitelná s vodou, je nutno vodu z tkání odstranit vzestupnou řadou alkoholů (odvodnění) a poté prosytit rozpouštědlem zalévacího media (xylen, toluen, aceton), který tkáň „projasní“.

Zalévání V malém množství se tkáň prosycuje parafinem v kádinkách v termostatu Pro provoz na patologii slouží přístroje na automatické zalévání

Krájení Tkáň je třeba nakrájet na řezy o tloušťce jedné vrstvy buněk, tedy 4-10mm. Tkáň je pak průhledná a „dobře čitelná“ Přístroje, které se k tomu užívají se jmenují mikrotomy. Nakrájené řezy se dávají na podložní sklo, kde se teplem natáhnou. K přilepení se používá bílek-glycerin

Mikrotom

Barvení Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání. Barviva jsou rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezu odstranit parafin. Po obarvení se řez montuje do pryskyřic. Tak vzniká trvalý preparát, který se prohlíží v mikroskopu.

Barvení Z řezů je třeba odstranit parafin a znovu je zavodnit, aby bylo možno tkáně barvit. Většina barviv je rozpustných ve vodě.

Trvalý preparát Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí kanadského balzámu ( má stejný lom světla jako sklo) nebo umělých pryskyřic Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT

Postup Parafínové řezy Kryostatové řezy Fixace Zmražení při – 170 oC Vypírání Odvodnění řadou alkoholů Prosycení rozpouštědlem Zalití do parafínu Krájení Krájení v kryostatu Nalepení řezů na podložní sklo Odparafínování a zavodnění Někdy krátká fixace Převedení do vody Barvení, histochemická reakce Zejména histochemické reakce Odvodnění a projasnění Někdy odvodnění a projasnění Montovací medium zpravidla bezvodé Bezvodé medium nebo glycerin -želatina

Mikroskop Stativ Optický systém: Mikrometrický šroub Okuláry Objektivy Kondenzor Zdroj

Rozlišovací schopnost Rozlišovací schopnost je nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, při které je ještě dovedeme rozlišit jako dva samostatné objekty. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 mm.

Barvení Přehledná Selektivní Hematoxylin eosin Massonovy trichromy Weigert van Gieson Heidenhainův železitý hematoxylin Selektivní Weigert resorcin fuchsin Impregnace stříbrem

Hematoxylin - eosin Hematoxylin barví kyselé součásti buňky (bazofilní struktury) – DNA, RNA, tj. jádro, jadérko, ribozomy a granulární endoplasmatické retikulum Eosin barví zásadité struktury buňky (acidofilní, eosinofilní) – což jsou hlavně proteiny, tj. cytoplasmu, mitochondrie, hladké endoplasmatické retikulum,a kolagen v mezibuněčné hmotě

Hematoxylin - eosin

AZAN Azokarmín barví jadra červeně Anilínová modř barví kolagenní vlákna a mucin modře Oranž G barví cytoplasmu buněk a svaly oranžově Erytrocyty jsou červené

AZAN

Weigert – van Gieson Weigertův hematoxylin barví jádra šedě Saturnová červeň (nebo kyselý fuchsin) barví kolagenní vlákna červeně Kyselina pikrová barví cytoplasmu buněk a svalovinu žlutě

Weigert van Gieson Nalepení řezů na podložní sklo

Weigert van Gieson

Hematoxylin - eosin

Weigert-van Gieson

Zelený Massonův trichrom Hematoxylin barví jádra modře až černě Kyselý fuchsin barví svalovinu červeně Světlá zeleň barví kolagenní vlákna zeleně. Erytrocyty jsou červené

Zelený Massonův trichrom

AZAN

Žlutý Massonův trichrom Hematoxylin barví jádra modře až černě Erythrosin barví svalovinu červeně Šafrán (Tuchechtgelb) barví kolagenní vlákna žlutě Erytrocyty jsou červené

Žlutý Massonův trichrom

Weigert resorcin - fuchsin Resorcin fuchsin barví elastická vlákna fialově Selektivní barvení na elastiku

Weigert resorcin - fuchsin

Heidenhainův železitý hematoxylin Heidenhainův železitý hematoxylin barví nejen jádra ale i cytoplasmu šedo-černě. Používá se pro barvení svalů a v parazitologii na průkaz parazitů (červů) v tkáních

Heidenhainův železitý hematoxylin

Heidenhainův železitý hematoxylin

Impregnace stříbrem Stříbro barví kolagenní a retikulární vlákna hnědě až černě. Impregnace stříbrem se používá i pro barvení neuronů a glie v neurohistologii.

Impregnace stříbrem

Kresylvioleť Kresyl violeť barví DNA a RNA v buňce fialově. Znázorní tedy jádro, jadérko, granulární endoplasmatické retikulum (Nisslovu substanci) v neuronech

Kresylvioleť

Kresylvioleť

Výsledky barvicích metod Barvení Barvivo Jádro Kolagen Elastika Svaly Poznámka Hematoxylin-eosin Hematoxylin Eosin modré až černé růžový růžové Weigert – van Gieson Weigertův hematoxylin Saturnová červeň Trinitrofenol hnědé červený žluté místo Saturnové červeni se používá také kyselý fuchsin, žluté -vše kromě kolagenu AZAN Azokarmín Anilínová modř Oranž G červené modrý oranžově červené červené - erytrocyty modrý - mucin Modrý Massonův trichrom Kyselý fuchsin Žlutý Massonův trichrom Erytrosin Šafrán žlutý červené – erytrocyty možno použít i kyselý fuchsin a Tuchecht gelb Zelený Massonův trichrom Světlá zeleň zelená Weigertův resorcin-fuchsin Resorcin Fuchsin fialová Impregnace Ag AgNO3 hnědý šedo-černé retikulární vlákna - černá Heidenhainův železitý hematoxylin HŽH Heidenhainův železitý hematoxylin hnědé až černé

Co je třeba umět? Co je to fixace? Proč a jak se dělá. Jak se připraví preparát – přehled. Základní barvení. Jak se co obarví. Proč se používají různá barvení? Barvení hematoxylinem – eosinem. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu