 Snaha o získání kultivací rostlinných explantátů in vitro PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ METABOLIZMUS Studium primárního metabolizmu Fotosyntéza, ovlivnění fotosyntézy vnějšími podmínkami, asimilace N, inhibice produkty, transport cukrů, akumulace rezervních látek…. Studium a využití sekundárního metabolizmu syntéza sekundárních metabolitů (známo asi 30 000 látek) biotransformace Rostliny -- zdroj - potravy - chemických látek léčiva insekticidy barviva aromatické látky látky obtížně získatelné jinou cestou  Snaha o získání kultivací rostlinných explantátů in vitro

 nutnost vysokých výtěžků Výhody kultivace in vitro: nezávislost na sezónní proměnlivosti (zkrácení doby) -“- škůdcích a chorobách -“- geografických a politických omezeních možnost řídit produkci podle potřeby -“- zajistit stálou kvalitu produktu Ale : ??? rentabilita produkce  nutnost vysokých výtěžků

 Dva základní přístupy k dosažení produkce sekundárních metabolitů: produkce v suspenzní buněčné kultuře imobilizace buněk – růst a produkce po prodloužený časový úsek Kultivace suspenzní buněčné kultury  stálá nezamýšlená selekce buněk s nejvyšší růstovou rychlostí – buňky malé, „ meristematické“, mitoticky aktivní Syntéza sek. metabolitů NE! u rychle rostoucích nediferencovaných buněk (často je nutný určitý stupeň diferenciace (morfologické, biochemické)  pomalejší růst In vivo akumulace sekundárních metabolitů často ve vysoce specializovaných buňkách, ale pozor !!, někdy specifická místa slouží jen ke skladování Ztráta produkce při dediferenciaci buněk  alternativa : kultivace organizovaných kultur kořenové kultury Př.: tkáňové kultury za podmínek diferenciace kořenů ---- produkce atropinu Potřeba nalézt podmínky, které vedou současně k dobrému růstu i dobré produkci 

Dvoustupňová kultivace 1. stupeň ---- pěstování na udržovacím (množícím) médiu – získání dostatečného množství biomasy 2. stupeň ----- pěstování na produkčním médiu indukce tvorby sekundárního metabolitu

Udržovací X produkční média Změna v mnoha složkách hormony – asi nejdůležitější faktor – rovnováha i koncentrace a typ, zejména auxinů a cytokininů minerální složení média největší vliv N, P, důležitá koncentrace i typ: NO3-, NH4+, močovina, aminokyseliny obvykle omezení zásobení N a P  potlačení růstu  zvýšení produkce Př.: Morinda citrifolia –  produkce antrachinonu … po  koncentrace PO3- Př.: Catharanthus roseus  produkce indolových alkaloidů po  koncentrace PO3- cukry  konc. z 1-2 % (udržovací médium)  5-10 %   produkce sek. metabolitů pH média organické přídavky Př.: Nicotiana tabacum  produkce nikotinu po snížení koncentrace NAA a KIN a vynechání hydrolyzátu kaseinu

  produkce sek. metabolitů stres - podmínky negativně působící na růst hormonální stres výživový stres (cukr, N, P, vzdušnění) chemický stres (antibiotika, těžké kovy, elicitory) osmotický stres stres infekce (mikroorganizmy, viry) světelný stres teplotní stres   produkce sek. metabolitů Př.:  produkce karotenoidů, flavonoidů, polyfenolů po  ozářenosti Př.:  produkce alkaloidů po ozáření modrým světlem Př.:  produkce alkaloidů při změnách teploty

Velkoobjemové kultivace Podmínky průmyslových kultivačních postupů – pěstování obdobné mikrob. kultivacím Ale !!! některé podstatné rozdíly Mikrob. kultura Rostlinná kultura Inokulační denzita Rychlost růstu Citlivost ke střižnému napětí Morfologie kultury Požadavky na vzdušnění malá velká jednotlivé buňky vysoké velká malá shluky nízké Rychlost růstu: čas zdvojení 1-3 dny, experiment trvá týdny  problém sterility Citlivost ke střižnému napětí: velké rozměry buněk,rigidní buněčná stěna, vakuola  nutnost specifických míchacích zařízení Uvolňování produktů – problém (hromadění ve vakuole)  dvoustupňový postup : hromadění- uvolňování

+ Imobilizace možnost znovupoužití biomasy oddělení buněk od produktu dobré prostorové využití kultivačních nádob dosažení kontinuálního procesu + Produkce kapsicinu nutnost získání vyhovujících linií vhodná imobilizační metoda uvolňování produktu do média Metody imobilizace Citlivost k mechanickému, osmotickému, výživovému stresu, teplotě , pH, O2  omezený výběr imobilizačních metod Co se nehodí ? - poutání na povrch kovalentní vazbou, zachycení do polyakrylamidu, vinylových polymerů Co se hodí ? -- alginát, agaróza, nosiče - nylon, někdy polyuretan Hlavní problém imobilizace – difúze látek Vytvoření mikroprostředí – závisí na velikosti částic, porozitě, míchání, koncentraci substrátu, distribuci biomasy uvnitř partikulí ??!! Někdy vhodné pro navození stresu

Př. : 1. průmyslově využívaná produkce – šikonin Př.: 1. průmyslově využívaná produkce – šikonin. Tradiční japonské léčivo a barvivo - producent Lithospermum erythrorhizon; v přírodě obsah 1-2%, v kulturách in vitro 12-15 %

 2002 zahájení komerční produkce taxolu Př.: 1. průmyslově využívaná produkce – šikonin. Tradiční japonské léčivo a barvivo - producent Lithospermum erythrorhizon; v přírodě obsah 1-2%, v kulturách in vitro 12-15 % Př: Produkce sekundárního metabolitu – léčivo taxol 1969 - objeveno nové protinádorové antibiotikum - taxol produkuje Taxus brevifolia 1983 – 1.fáze klinických testů – v současnosti jedno z nejdůležitějších cytostatik, prototyp nové řady antibiotik Ale !!! K získání 1 kg taxolu je třeba 700 – 900 kg kůry tisu  Snaha o produkci látky kulturami in vitro    založení tkáňových kultur  různé typy primárních explantátů  média  růstové regulátory  sacharidy  antioxidanty  adsorbenty fenolických látek  světelné podmínky  teplota elicitace  přídavky prekurzorů  infekce Agrobacteriem     Odvozeny linie s 40x vyšším obsahem taxolu než je v kůře T. brevifolia, suspenzní kultury produkující 20 mg taxolu v 1l média  2002 zahájení komerční produkce taxolu

Př.: chinin Cinchona officinalis antimalarikum dogoxin Digitalis lanata kardiotonikum morfin Papaver somniferum analgetikum thebain Papaver bracteatum zdroj kodeinu scopolamin Datura stramonium snížení krevního tlaku atropin Atropa beladona spasmolytikum steviocid Stevia rebaudiana sladidlo kapsicin Capsicum frutescens léčivo jasmin Jasminum spp. parfém pyrethriny Chrysanthemum cinerariaefolium insekticidy   Datura .. Durman Atropa rulík

Biotransformace Př: Biotransformace Př: Biotransformace za použití : suspenzních kultur imobilizovaných buněk částí buněk izolovaných enzymů Biotransformace Ztráta schopnosti syntetizovat sekundární metabolit, ale zachování aktivit některých enzymů Možnost modifikace přirozených syntetických látek ... oxidace, redukce, hydroxylace, metylace, glykosylace, esterifikace, epoxidace… Př: Biotransformace digitoxin  digoxin Obě látky produkuje Digitalis lanata , ale účinné kardiotonikum je digoxin, rostlina produkuje zejména digitoxin Zvládnuta biotransformace digitoxinu suspenzními buněčnými kulturami nebo imobilizovanými buňkami D. lanata Př: Biotransformace steviol (aglykon)  steviocid, steviobiocid Zvládnuta biotransformace steviolu suspenzními buněčnými kulturami Stevia rebaudiana a Digitalis purpurea