(Pre)historie buněčného cyklu. Základní pojmy, modely a metody.

Definice BC Buněčný cyklus je posloupnost událostí, kterými z jedné buňky vzniká větší počet buněk, zpravidla dvě. typická biologická definice BC je (také) „minimální ontogeneze“ - včetně morfogenetických aspektů!

(B. Němec, 1900?)

Inoue, 50. léta: „vláknité struktury“ (meiose mikrospor Lilium longiflorum)

Endosperm, Haemanthus sp.

Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) Mikroskopické metody: od barvení k GFP, SEM a konfokální mikroskopii

Buněčný cyklus a morfogeneze – úhly pohledu Strukturní události (replikace DNA, segregace chromozómů, cytokineze) Začlenění do ontogeneze mnohobuněčného organismu Regulační stránka

??? Why do events occur in a particular order? How are superficially unrelated events kept in phase? How are growth and division co-ordinated? How does the cell know where to locate new structures? (A.E. Wheals, 1976)

Obecné schéma eukaryotního buněčného cyklu (G0) „eukaryotní b. se drží v G1“

Identifikace fází BC: metoda FLM (frequency of labelled mitoses) Howard, A. & Pelc, S. Heredity 6 (suppl.), 261–273 (1953) - na buňkách kořene bobu!

Metoda FLM přímo měří trvání fází ... ale je velmi pracná: 3H thymidin toxický ... nutno slabé značení (autoradiografováno 3 měsíce!) (Prescott, 1976)

Kde (pokud vůbec) buňky odcházejí z cyklu, a kde tráví většinu času? (G0) „eukaryotní b. se drží v G1“

FACS: moderní „alternativa“ FLM (ale měří něco jiného - zastoupení buněk v jednotlivých fázích!)

(J. Doležal, ÚEB)

Odbočka: metody studia (nejen) časového rozvrhu BC Pozorování (sensu lato): Mikroskopie FLM (frekvence značených mitóz FACS Synchronizace Přirozená Indukční Selekční

Přirozeně synchronní buňky: embrya bezobratlých a obojživelníků

Indukční synchronizace Hladověním stacionární fáze, spory specificky - P, Si (rozsivky), světlo (řasy) auxotrofové Specifickou inhibicí procesů BC inhibitory - nocodazol (mt) signální působky (a faktor kvasinek) mutace Chlorella sp.

Synchronizace pučivé kvasinky a - faktorem

Selekční synchronizace savčích buněk in vitro setřepáním buněk v M fibroblasty (Gough lab)

Selekční synchronizace

Selekční synchronizace - „baby machine“ „lepkavý“ filtr (polylysin, lektiny) (Helmstetter et al.)

Další možnosti selekční synchronizace Centrifugace do rovnováhy (isopyknická) autospory Chlorella sp. ve ficollu Dělení podle velikosti (při stálé hustotě), t.j. podle odporu při centrifugaci klasicky - lineární sacharózový gradient moderně - elutriace Pozor na shluky!

Synchronizace (kvasinek) centrifugální elutriací

Ať už synchronizujeme jakkoli, dlouho to nevydrží. (Prescott 1976)

Složení reálných populací: kde v BC jsou rostlinné buňky? (metodou FACS)

Trvání eukaryotního BC - příklady Saccharomyces - v bohatém médiu 1,5-2 h Drosophila: 6 min až 10 hod M S M M S G2 G1 G2 S 6 min 10 h

Schizosaccharomyces pombe - fission yeast - poltivá kvasinka Lindner, Wochenschrift für Brauerei 10:1298-1300, 1893

Porovnání pučivé a poltivé kvasinky: proč se liší?

S. cerevisiae S. pombe Metazoa

Odchylky od obecného schématu: lze vynechat fáze? Meioza: „2 mitózy na 1 replikaci“ Embryonální cykly: rýhování bez růstu Polytenní chromozómy a jiné „speciality“: endoreduplikace (G0) „eukaryotní b. se drží v G1“

Cykly bez cytokineze: endosperm, embryo Drosophily ... (Ohad et al. 1999) fie (fertilisation-independent endosperm), Arabidopsis (Sullivan et al., www)

Cykly s jiným počtem dceřinných buněk: Cn („větší počet buněk, zpravidla dvě“) Scenedesmus quadricauda Cn ... 2n n = 1 - 15!

Životní cyklus Scenedesmus sp. (Zachleder 1995) www.alga.cz

Chlamydomonas sp. C2

Varianty BC - shrnutí Co je původní?

Prokaryotní buněčné cykly (u pomalých synchronních kultur zjištěna „S fáze“!) (Atlung 2004)

ALE při rychlejším růstu replikace kontinuální! Překryvné cykly, neustálá akumulace 3H thymidinu (Schaechter,Bentzon,Maaløe, 1959)

Jsou všechny regulační kroky nezbytné? (Donachie 1992 - E. coli) suprimovaní oriC- mutanti: bez kontroly velikostí par- mutanti: replikace bez septace sulA- mutanti: ztráta kontroly integrity DNA minCDE- mutanti: náhodná lokalizace sept

Evoluce cyklu: první buňky zřejmě měly cyklus typu Cn