Genetika v zubním lékařství II 23. 2. 2009

Obecná struktura nukleotidů.

Chemická struktura pentózy Chemická struktura pentózy. Ribóza v RNA a deoxyribóza v DNA (ztráza kyslíku na atomu C2'. 

Báze Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Thymin (T), and Uracil (U) Báze Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Thymin (T), and Uracil (U). A, C, G a T v DNA DNA; A, C, G a U v RNA.

Transkripce i) Vazba polymeráz na iniciační místo.  Sekvence DNA, která signalizuje začátek transkripce, je promotor. Eukaryotické polymerázy se vážou na tzv. transkripční faktory ii) Rozvinutí dvojšroubovice DNA pomocí helikázy a specifického transkripčního faktoru. (iii) Syntéza RNA podle DNA matrice.  RNA polymerázy používají nukleozid trifosfáty ke konstrukci RNA. (iv) Ukončení syntézy.  

Transkripce

Replikace DNA

Amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) Amplifikace = zesílení, v případě DNA zmnožení. Polymerázová řetězová reakce (PCR = Polymerase Chain Reaction) = biochemická reakce, která využívá enzym DNA-polymerázu ke kopírování DNA takovým způsobem, že se produkt hromadí podobnou geometrickou řadou, jakou dochází k šíření rozpadu atomů při výbuchu atomové bomby

Jaký je princip PCR? DNA-polymeráza je schopná syntetizovat komplementární vlákno podle templátu jednovláknové DNA tak, že přidává k existujícímu úseku druhého vlákna nové nukleotidy ve směru 5' > 3'. K tomu kromě templátového vlákna a nukleotidtrifosfátů potřebuje krátký existující úsek druhého vlákna, tzv. primer, který můžeme syntetizovat uměle jako oligonukleotid.

Princip PCR Pokud známe sekvenci templátového vlákna, můžeme si připravit primer, který bude za vhodných teplotních podmínek tvořit vodíkové můstky s komplementární sekvencí v templátovém vlákně (tzv. nasedání primeru). Takto jsme schopni určit DNA-polymeráze, od kterého místa a kterým směrem (od 3'-konce primeru) má začít syntetizovat komplementární vlákno. Hovoříme o tzv. extenzi primeru (prodlužování primeru přidáváním dalších nukleotidů na 3'-konci).

Princip PCR Podle jednoho templátového vlákna ale tímto způsobem vznikne jen jedna kopie, takže nedojde k žádnému řetězovému hromadění produktu. To je v PCR zajištěno použitím dvou primerů, které nasedají na komplementární sekvence ve dvou templátových vláknech. Templátová vlákna vznikají denaturací původně dvouvláknové DNA. Primery na tato vlákna nasedají v protisměrné orientaci, takže po opakovaných cyklech denaturace, nasedání primeru a extenze primeru DNA-polymerázou vznikají produkty, které slouží jako templáty pro nový reakční cyklus.

Princip PCR Máme-li tedy teoreticky na začátku k dispozici dvě templátová vlákna (jednu dvojvláknovou molekulu), pak vzniknou v prvním cyklu dvě kopie. Pro další cyklus máme k dispozici už čtyři vlákna, podle kterých vzniknou 4 kopie. Celkem osm templátových vláken slouží v dalším cyklu k syntéze dalších osmi vláken, takže se produkt hromadí geometrickou řadou. Ze 2 vláken získáme po 30 cyklech teoreticky celkem 230 = 107 370 000 kopií (tj. 107 milionů kopií).

Polymerase Chain Reaction Protože na začátku každého cyklu musíme denaturovat templátovou DNA vysokou teplotou, která ničí normální DNA-polymerázy, musíme při PCR používat tzv. termostabilní polymerázy. Tyto enzymy pocházejí z bakterií, žijících v extrémních podmínkách, např. v hloubce moří poblíž ústí podmořských sopek. Jejich proteinová struktura je evolucí uzpůsobena tak, že odolává po určitou dobu i teplotám kolem 95 °C. Nejčastěji se používá tzv. Taq-polymeráza, nazvaná podle bakterie Thermus aquaticus.

Primery Pro každou PCR, která má za cíl amplifikovat konkrétní úsek templátové DNA, je potřeba navrhnout vhodný pár primerů.  Při návrhu primerů musíme zajistit, aby oba primery nasedly při stejné teplotě jen na přesně komplementární sekvenci v templátové DNA. Kdyby nasedaly nejen na přesně komplementární sekvence, tedy i jinde v templátové DNA, nedošlo by k efektivní amplifikaci zvoleného úseku.

Primery Proto musejí mít oba primery shodnou, nebo téměř shodnou teplotu tání. Ta závisí na délce molekuly (delší molekula = více vodíkových můstků = větší energie nutná k denaturaci) a na její sekvenci, přesněji řečeno na poměru G-C párů a A-T párů v sekvenci (mezi G-C jsou tři vodíkové můstky, mezi A-T jen dva, proto čím více G-T párů, tím vyšší teplota tání). Teplotu tání konkrétní sekvence určité sondy lze určit buď výpočtem, nebo experimentálně. Vlastní teplota nasedání primerů musí pak být o něco nižší, než teplota tání - pokud bychom použili přímo teplotu tání, bylo by nasednutí příliš nestabilní. Konkrétní použitou teplotu nasedání je často nutné určit experimentálně - tzv. optimalizovat podmínky reakce.

Primery Kromě požadavku na shodnou teplotu tání musí konkrétní pár primerů splňovat i další požadavky - nesmí tvořit tzv. dimery a vlásenky. Dimer vzniká spárováním dvou primerů navzájem a podmínkou jeho vzniku je delší komplementární úsek v sekvenci obou primerů. Pokud je příliš stabilní, může jeho tvorba převážit nad nasedáním primerů na templátovou DNA a PCR neproběhne. Vlásenky vznikají spárováním konců stejného primeru navzájem, opět v případě, kdy je dostatečná komplementarita mezi konci téhož primeru. Protože může vyřadit jeden z primerů z nasedání na templátové vlákno, má stejné následky - PCR neproběhne. Respektování všech požadavků na vlastnosti primerů při tzv. manuálním navrhování (tedy s použitím pouze tužky, papíru a kalkulačky) vyžaduje zkušenosti a cvik. Rychlejší a přesnější je využití různých typů softwaru, které jsou schopny navrhnout nejlepší primery pro amplifikaci zadané sekvence (http://frodo.wi.mit.edu/).

Praktické provedené PCR Cyklické změny teplot reakční směsi lze řídit automatizovaně pomocí tzv. termocykleru. Zkumavky s reakční směsí jsou v termocykleru uloženy v kovovém bloku, jehož teplota je řízena podle programu, nastaveného uživatelem. Reakční směs je podobně jako u jiných biochemických reakcí sestavena v mikrozkumavce, odlišnost spočívá v tom, že mikrozkumavka musí být tenkostěnná, aby umožňovala rychlé změny teplot vzorku.

Hodnocení PCR http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html Výsledek PCR amplifikace lze tzv. detekovat na gelu, tzn. že se vzorek reakční směsi nanese na start agarózového nebo polyakrylamidového gelu a podrobí se elektroforéze. Pokud primery nasedaly jen na vybraná protisměrně umístěná místa, vznikly jako produkt reakce molekuly stejné sekvence a délky, dané vzdáleností míst, na které nasedaly primery.

Elektroforéza Elektroforéza je soubor separačních metod, které využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při ní dělí nabité molekuly (ionty). Při separaci látek v kapiláře se zde vedle elektroforetického principu (pohyb nabitých molekul v elektrickém poli) uplatňuje též elektroosmotický tok (angl. electroosmotic flow, EOF), což je spontánní tok kapaliny v kapiláře v důsledku náboje (obvykle záporného) na vnitřní stěně kapiláry.

Hodnocení elektroforézy Při dělení v gelu budou všechny tyto molekuly putovat stejnou rychlostí a po obarvení a zobrazení uvidíme jen jeden pruh, jehož molekulová hmotnost odpovídá při srovnání se standardem předpokládané délce molekuly. Pokud není zobrazen žádný pruh, polymerázová řetězová reakce neproběhla, pokud je zobrazeno více pruhů, tak sice PCR proběhla, ale primery nasedaly na více místech, které byly shodou okolností také orientovány protisměrně, takže došlo k amplifikaci více produktů. V takovém případě je nutné optimalizovat podmínky reakce.

Restrikční analýza Při dělení v gelu budou všechny tyto molekuly putovat stejnou rychlostí a po obarvení a zobrazení uvidíme jen jeden pruh, jehož molekulová hmotnost odpovídá při srovnání se standardem předpokládané délce molekuly. Pokud není zobrazen žádný pruh, polymerázová řetězová reakce neproběhla, pokud je zobrazeno více pruhů, tak sice PCR proběhla, ale primery nasedaly na více místech, které byly shodou okolností také orientovány protisměrně, takže došlo k amplifikaci více produktů. V takovém případě je nutné optimalizovat podmínky reakce.

Kvantitativní PCR v reálném čase Množství produktu, vytvořeného amplifikací, závisí v každé PCR na množství templátové DNA, která je přidána do reakce. Reakce tedy probíhá tzv. kvantitativně. Hrubé určení množství produktu je možné posouzením intenzity pruhu, který se objeví po rozdělení výsledku PCR na gelu. Přesné určení tohoto množství je možné pomocí sondy označené fluorescenčním barvivem. Tato sonda musí být navržena tak, aby hybridizovala s templátovou DNA za stejných podmínek jako primery, a to tak, že nasedne na templátovou DNA v místě mezi místy nasednutí obou protisměrně orientovaných primerů. DNA-polymeráza, která provádí extenzi jednoho ze dvou primerů, narazí při syntéze komplementárního vlákna na nasedlou sondu.

Kvantitativní PCR v reálném čase Protože DNA-polymeráza má kromě své schopnosti syntetizovat komplementární vlákno také tzv. exonukleázovou aktivitu, odbourá nasedlou sondu. Při odbourávání uvolní jednotlivé nukleotidy sondy, z nichž některé jsou označeny fluorescenčním barvivem. Pro tento typ sond se přitom používá fluorescenční barvivo, které není schopné fluorescence, dokud je vázáno ve struktuře sondy. Jakmile se ale uvolní do roztoku, tak schopnost fluorescence získá. 

Co je to kvantitativní PCR v reálném čase? V průběhu PCR tak dochází k uvolňování dalších a dalších molekul fluorescenčního barviva, takže roste fluorescence reakční směsi. Tento nárůst je přímo úměrný množství produktu, který v reakci vzniká. Speciální termocyklery, určené pro kvantitativní PCR v reálném čase, jsou schopny v průběhu PCR ozařovat vzorek excitačním zářením, které vybudí fluorescenci uvolněného barviva.

Kvantitativní PCR v reálném čase Tuto fluorescenci přístroj po každém cyklu změří a výsledek předá řídícímu softwaru, který zobrazuje průběžně - v reálném čase - množství uvolněné fluorescence, které odpovídá množství vzniklého produktu. Výsledek reakce tak známe často dřív, než proběhnou všechny cykly. Kromě tohoto urychlení a vypuštění zdlouhavé detekce produktu na gelu je tato technika hlavně výhodná tam, kde potřebujeme znát přesné množství vstupní templátové DNA - zejména u sledování exprese genů pomocí tzv. reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce (RT-PCR).

Nevýhody PCR PCR má velmi široké použití ve výzkumu i v lékařské diagnostice. Pokud ovšem používáme klasickou Taq-polymerázu, má PCR svá omezení: Taq-polymeráza nemá tzv. korektorskou aktivitu, takže při syntéze nového vlákna dělá chyby. Protože v PCR je produkt předchozího cyklu syntézy templátem pro další cykly syntézy, tyto chyby se hromadí.

Nevýhody PCR Taq-polymeráza také nedokáže efektivně syntetizovat produkty delší než cca 3-15 tisíc párů bází (skutečná výkonnost závisí na zdroji DNA - z malých genomů probíhá amplifikace určitých úseků snadněji než z velkých genomů). Obě nevýhody lze obejít použitím termostabilních polymeráz s korektorskou aktivitou.

Výhody PCR Hlavní výhodou PCR, ze které těží také lékařská diagnostika, je její vysoká citlivost. Protože dokáže z pouhých 2 vláken vytvořit po 30 cyklech 230 molekul produktu (107 milionů), stačí pro pomnožení určité sekvence velmi malé množství DNA. Protože PCR funguje pouze v případě, že na templátová vlákna nasednou primery, lze toho využít např. při detekci patogenních mikroorganismů v krvi pacienta - genetická informace těchto organismů se liší od lidské, takže je možné navrhnout primery, které budou fungovat pouze v případě, že se v krvi vyskytne DNA patogena. PCR je zejména vhodná k detekci virů, mykobakterií a některých dalších mikroorganismů.

Lidské chromosomy morfologicky barvitelné pouze v průběhu mitózy nebo meiózy, kdy dochází ke kondenzaci v diploidní buňce 23 párů homologních chromosomů (22 párů autosomů a 2 pohlavní chromosomy)

Vyšetření karyotypu odběr buněk, schopných intenzivního dělení (dostatek mitóz) kultivace ve vhodném médiu se stimulátorem dělení Fytohemaglutinin: phyto = rostlina, haem = krev, agglutinate = shlukovat tj. látka rostlinného původu (tzv. lektin), způsobující při přidání ke krvi shlukování červených krvinek erytrocyt PHA erytrocyt povrchový antigen

zastavení v metafázi mitózy inhibitorem sestavování mikrotubulů kolchicin: tzv. vřeténkový jed z ocúnu (Colchicum autumnale) zvětšení objemu buněk a jader přidáním hypotonického roztoku fixace a nakapání na podložní sklo, během odpařování fixáže se „mitotické figury“ rozprostřou do plochy u pruhovacích technik ošetření denaturací, typicky trypsinem (hydrolytická proteáza odstraní proteiny v méně kondenzovaných částech chromosomů) barvení, nejčastěji Giemsou pozorování, fotografování, identifikace chromosomů, sestavení karyotypu

Pruhovací techniky Q G R C Q = quinacrine, chinakrin, fluorescenční barvivo, které se váže na oblasti bohaté na AT-páry G = Giemsa po trypsinu, stejné oblasti jako u Q R = reverzní, opačné, vysoká teplota a nízké pH, pak se barví GC-bohaté oblasti C = kyselina, pak louh, odstraní asi 60% DNA, zůstane jen konstitutivní heterochromatin (constitutive heterochromatin)

High-resolution banding těsně před metafází střední metafáze časná metafáze pozdní profáze Chromosom č. 1

G-pruhy na lidských chromosomech

Karyotyp podle Denverské klasifikace

Detekce chromosomů pomocí sond zelená = 13 zelená = X červená = Y zelená = X modrá = 18 červená = 21 modrá = 18 nejsou nezbytné dělící se buňky  okamžitý výsledek konkrétní centromerická sonda detekuje jen centromeru určitého chromosomu

Spektrální karyotypizace (SKY)

Sekvenace DNA Cíl: Najít kompletní pořadí nukleotidů A, C, G, T v DNA

Sekvenace DNA http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html Používá se ke zjištění skutečné sekvence DNA. Nejobvyklejší metodou je metoda „dideoxy“ method. Tato metoda používá dideoxynukleotidové trifosfáty (ddNTPs), které mají místo OH na uhlíku 3’ v molekule ribózy u deoxynukleotidových trifosfátů (dNTPs) jen H. Dideoxynukleotidy jsou terminátory řetězců. Je li v syntetické reakci místo deoxynukleotidu přidán dideoxynukletid, systéza se v tomto bodě zastaví, protože chybí OH skupina v poloze 3 ´, nutná pro přidání dalšího nukleotidu.

Deoxy versus dideoxy

Syntéza DNA

DNA sekvenace

Elektroforetický obraz

Genová terapie: typy nemocí Infekční nemoci Rakoviny Vrozené nemoci Nemoci imunitního systému

Genová terapie Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta. Do buněk se transferují: geny, jejich části nebo oligonukleotidy. Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta Genová terapie in vitro: genové modifikace probíhají mimo organismus Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do organismu

Genová terapie Klasická genetická terapie (dopravit geny do vhodných cílových buněk, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů) s cílem: 1. zajistit produkci látky, která chybí 2. aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky

Technologie klasické genetické terapie Jedná se o zacílení buněk nemocné tkáně Geny mohou inzertovány do buněk pacienta přímo a nepřímo Inzertované geny se mohou Integrovat do chromozomů Zůstat extrachromozomálně (epizomy)

Genetický transfer Ex vivo Transfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk) In vivo Transfer se děje přímo do tkáně pacienta. Pomocí liposomů nebo virových vektorů.

Principy genetického transferu cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce genu se děje A) do chromozomu gen se bude rozšiřovat do dalších buněk zajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky) náhodná inzerce-různá lokalizace –různá úroveň exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo. B) extrachromozomálně – nevýhoda nejistého dlouhodobého účinku

Neklasická genová terapie Inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací. Etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací.

Genová terapie a jiné terapeutické molekulárně genetické přístupy Rekombinantní proteiny a „genetically engineered“ vakcíny Expresním klonováním produktů normálního genu (klonované geny jsou exprimovány v mikroorganismech nebo transgenních organismech), které slouží k tvorbě velkých množství medicínsky cenných produktů Produkcí geneticky „engineering“ protilátek (geny pro protilátky jsou manipulovány k tvorbě nových částečně nebo plně humanizovaných protilátek) pro terapeutické použití Produkcí „genetically engineered“ vakcín-především proti tumorům a infekčním agens.

Rekombinantní bílkoviny je možno produkovat expresním klonováním v mikroorganismech nebo v transgenních zvířatech V mikroorganismech: Výhody: dostatečná množství produkovaných látek Nevýhody: Pozměněné produkty v důsledku odlišných posttranslačních úprav bílkovin se stejnou primární strukturou (glykosylace) problémy s purifikací V transgenních zvířatech: možnost navodit podobné posttranslační systémy jako u člověka

Chimerické a humanizované protilátky Rekombinantní protilátky humánní-hlodavčí Humanizace hlodavčích mAb umožňuje získat velké množství protilátek a zároveň zabránit imunitní odpovědi lidského příjemce: chimerické V/C protilátky) CDR (complementarity determining regions) graft protilátky Infekční patogeny a antigeny nádorových buněk

„Geneticky enginnered“ vakcíny Genetická modifikace antigenu – např. fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení antigenicity Genetická modifikace virů- virové vektory Genetické modifikace mikroorganismů, které způsobí: odstranění genů nutných pro patogenezu expresi exogenního genu v bakteriích nebo parazitech po jeho inzerci do těchto organismů

Triáda „Tissue Engineering“. Tři hlavní složky tkáně: buňky, extracelulární matrix a signální systém. E. L. SCHELLER*, P. H. KREBSBACH* & D. H. KOHN*,2009

Tissue Engineering v praxi: – temporomandibulární kloub. (a) design teoretického, místně specifického implantátu temporomandibulárního kloubu pomocí pevné výroby bez formy (b) Kompozitní konstrukce z PLLA s diferencovanými prasečími chondrocyty a hydroxyapatitem (HA). (c) Implantát za 4 týdny po implantaci. Review Article Tissue engineering: state of the art in oral rehabilitation E. L. SCHELLER*, P. H. KREBSBACH* & D. H. KOHN*,† *Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, J Oral Rehabil. 2009 Feb 17. [Epub ahead of print –doporučuji přečíst! ! !

Farmakogenetika - cíle Popsat vliv dědičnosti na odpověd organismu na různé látky s využitím interdisciplinárního přístupu Farmakogenomika Farmakodynamika: popisuje žádoucí či nežádoucí účinky léků na organismus (lék organismus) Farmakokinetika: se zabývá hladinami léků a jeho metabolitů v různých tkáních a vstřebáváním léků, jejich distribucí, metabolismem a eliminací (organismus  lék)

Klíčové složky farmakogenetiky

Klinický potenciál farmakogenetiky

Farmakodynamika Efekt kompetitivní (guanetidin + efedrin) Efekt aditivní (IMAO a tricyklická antidepresiva) Efekt antagonistický (salbutamol + betablokátory)

Farmokodynamika x farmakogenomika Různá odpověď pacientů téže populační skupiny na tentýž lék Různá odpověď pacientů na kombinace týchž léků Geneticky determinovaná přecitlivělost na danou látku

Farmakokinetika Absorpce (GIT, motilita?, pH žaludeční sekrece?, intestinální flóra?, místo absorpce) Distribuce (frakce léčiva vázaná na bílkoviny séra, afinita jednotlivých léčiv k BS – fenylbutazon-warfarin) Metabolismus (indukce, inhibice metabolizujících enzymů... rifampicin-orální kontraceptiva) Eliminace (pH moči, lithium-thiazidy)

Farmakokinetika x farmakogenomika Rozdílné hladiny léku v séru pacientů téže skupiny, váhy, atd. po podání stejné dávky Rychlejší x pomalejší nástup účinku Různá doba eliminace léčiva z organismu Interakce (alkohol, tabák, barbituráty)

Farmakogenetika a vývoj léků Nutnost přesné diagnózy (k fenotypicky podobným stavům mohou vést různé patobiochemické mechanismy). Individuální odpověď jedince na terapii může záležet na genech, vstupujících do interakce s metabolismem léku nebo jeho působením. Polovina všech dosud používaných léků je metabolizována enzymy P450.

P450 CYP3A4 – 50% metabolizovaných léků CYP2D6 – 20% CYP2D9 + CYP2D19- 15 % CYP2D6, CYP2D9, CYP2D19 a CYP2A6 byly prokázány jako funkčně polymorfní

Kandidátní geny - asociace s intermediálním fenotypem s klinickou manifestací nemoci s klinickou závažností nemoci s odpovídavostí nemoci na léčbu

Zdraví čeští dobrovolníci středního věku (41-50 let) Polymorfismus -596 A/G v genu pro IL-6 Srdeční frekvence Pg=0,006 Pa=0,01 Genotypy AG+GG uvedeného polymorfismu jsou častější u jedinců s vyšší srdeční frekvencí (OR=4,27, 95% KI 1,66-10,98, P=0,0009). Vašků A et al. Physiol Res 2003

Chronické srdeční selhání Polymorfismus -790T/G v genu pro MMP-2 Celkový cholesterol Pg=0,03 Pa=0,01 Genotypy TG + GG přinášejí 3,59x vyšší OR pro muže s CHF a vyšší hladinou celkového cholesterolu: OR=3,59; 95% KI 1,30-9,93; P=0,009 Vašků A et al. Clin Chem Lab Med 41:1299-1304, 2003

Děkuji Vám za pozornost