Muskulární dystrofie typu Duchenne (Becker) B. Ravčuková , J Muskulární dystrofie typu Duchenne (Becker) B. Ravčuková , J.Kadlecová, I.Valášková, A.Kratochvílová odd. lékařské genetiky FN Brno prim. MUDr Renata Gaillyová

Klinické projevy - těžká, progredující monogenně dědičná choroba - X - recesivní (incidence 1:3500 novorozenců mužského pohlaví) - destrukce svalových vláken, vedoucí k invaliditě a předčasnému úmrtí na konci druhé dekády života - špatné držení těla - potíže při zvedání ze země - narůstající svalová slabost - pseudohypertrofie lýtek - lordóza - často zpožděný nástup chůze a mluvy - zvýšená hladina fosfokreatinkinázy - mnohdy nižší tělesná výška - u většiny pacientů abnormální elektrokardiogram - někdy gastroparéza ( ochrnutí a rozšíření žaludku) -epizodické zvracení - mírná mentální retardace (asi u 1/3 případů)

Gen a jeho produkt - lokalizace : Xp21 Gen a jeho produkt - lokalizace : Xp21.2 - jeden z největších lidských genů - velikost genu: 2,4Mb (asi 1% chromozomu X, 0,05% lidské DNA) - velikost mRNA : 14kb - produkt genu: protein dystrofin - tvořen 3 685 AK - molekulová hmotnost: 427kD - tvořen 4 odlišnými strukturními doménami: A/aktin vázající amino-koncová doména, spojující dystrofin s membránovým cytoskeletem B/ šroubovicový střední úsek C/ doména bohatá na cystein D/ karboxy-koncová doména, tvořící interakce s membránovými proteiny

Exprese dystrofinu - v různých tkáních( umožněno alternativním sestřihem v 3´a 5´-koncové oblasti - strukturní a funkční úpravy - různé formy dystrofinu ve svalech (kosterní, srdeční, hladké) orgánech (ledviny, játra, plíce, slinivka) CNS (neurony, gliové b.) periferní NS - na úrovni genu exprese dystrofinu řízena 7 promotory: promotory C(cortical),M(muscle),P(Purkinje) -exprese celého genu promotory R(retinal)-od ex.30., CNS-od ex.45, S(Schwann cell)-od ex.56, G(glial cell)-od ex. 63 - funkce dystrofinu: - stabilizace membrány během kontrakce sval. buněk - transdukce kontraktilní síly z intacelulární domény do okolí - vazba C-doménou k membránovým glykoproteinům DAGC (Dystrophin Associated Glycoprotein Complex) - membránové spec.funkce v nekontraktilních tkáních

Přímá diagnostika - gen: velikost 2,4Mb 79 exonů vysoká mutační rychlost ( u 1/3 pacientů mutace de novo) - na úrovni DNA detekujeme deleční mutace (2/3 všech mutací u postižených, většinou vznikají během oogeneze - Tuffery et al 1998) - ostatní typy mutací méně časté (bodové mutace vznikají během spermatogeneze) - na úrovni mRNA (tvoří 0,02-0,12% celkové mRNA ve zralých svalových buňkách) se provádí RT-PCR , transkripce a translace in vitro(PTT-Protein Truncation Test)

Na úrovni DNA - multiplex PCR (Chamberlain, Beggs, 1990, Abbs a kol Na úrovni DNA - multiplex PCR (Chamberlain, Beggs, 1990, Abbs a kol., 1991) - syntézou 19 exonů může být nalezeno 98% mutací u probandů Legenda: A - zdravý jedinec B - proband s dg DMD s detekovanou delecí ex.51,52,53 Amplifikační produkty byly analyzovány v polyakrylamidovém gelu a následně barveny dusičnanem stříbrným. Starty 1,6 - ex.4(196bp),8(360bp),19(459bp) 2,7 - ex.Pm(535bp),3(410bp),6(202bp), 13(238bp),43(357bp) 3,8 - ex.47(181bp),49(439bp),50(271bp) 52(113bp),60(139bp) 4,9 - ex.42(155bp),44(426bp),45(307bp) 48(506bp),51(388bp),53(212bp) 5 - marker pBR322/AluI

Nepřímá diagnostika na úrovni DNA - využívá se pro určení žen-přenašeček 1/ je možná v rodinách s dvěma a více jedinci s klinicky potvrzenou diagnózou - využívá polymorfních míst uvnitř genu ( v intronech) - čím více polymorfních míst, tím přesnější diagnostika 2/ umožní rozlišit dva chromozomy pomocí polymorfních míst (markerů) 3/ umožní přiřadit markery (a tím i chromozom) k patologii v rodině

Rodina P. (u probanda III/1 detekována delece exonů 45-52) M I/2 I/1 II/4 III/1 II/2 III/2 III/3 II/1 R P O 150 bp

Rodina I. (u probanda II/1 nebyla detekována delece v genu pro dystrofin) K K K L K L

Závěr - přímá DNA diagnostika potvrdí vyřčenou diagnozu nálezem mutace - nepřímá DNA diagnostika nikdy nepotvrdí diagnozu, pouze umožní s určitou pravděpodobností přiřadit chromozom dané patologii v dané rodině ----------------------------------------------- Genová terapie 1993 - pokusy na myších s využitím částí dystrofinové molekuly - využití funkční redundance různých forem dystrofinu a členů dystrofinové rodiny Nyní (Clemens et al 2001) - pokrok v designu vektoru - vysokokapacitní adenovirové vektory nebo adenovirům podobné vektory Další možnosti: - čtení i přes stop-kodon - „oprava“ bodových mutací užitím chimerických oligo- nukleotidů