J. Weiser Laboratoř mikrobiální proteomiky Proteomika jako nástroj ke studiu fyziologických regulací u bakterií

acgtaagctagcttagc Bakteriální buňka Genom Proteomy Balancovaný růst Hladovění Stres Post-translační modifikace Od genomu k transkriptomům, proteomům a dalším -biomům Transkriptomy ? Metabolomy

Dělení směsí proteinů Technologie studia proteomů příprava vzorků 2D elektroforéza Obrazová analýza gelů Expresní profily Statistická analýza dat Modelování regulačních sítí Identifikace proteinů LC-MS-MS a jiné vícerozměrné chromatografické metody Identifikace proteinů ICAT SILAC 18 O labelling Expresní profily Identifikace proteinů

- Streptomyces noursei, barveno stříbrem SDS (M r ) IEF (pI) pH 3 pH 10 kyselé bazické Velké 100 kD 10 KD malé Vysokorozlišovací 2D elektroforéza proteinů IEF Trubičkový gel IPG proužek

Antibiotika producenti – resistence Streptomycety - Escherichia coli primární metabolizmus sekundární metabolizmus Simulace přirozeného životního prostředí kultivace na skleněných kuličkách kontinuální kultivace

Sample preparation and processing life cycle entry life cycle exit sample processing myceliumspores cell disintegration grinding in mortar bead beater extraction sample analysis

Biosyntetická dráha chlortetracyklinu - nové poznatky S.aureofaciens MYTFINRFTVTGDVAEFETLVGEIS S.rimosus VTFINRFTVQGDAAEFEKRVGEIT EFMSGRPGFR AHMSRQPGFR 13Ka 13Kb Tetracyklin dehydrogenáza 2 izoformy N-terminální sekvence analog u S.rimosus Anhydrotetracyklin monooxygenáza - 4 izoformy a jejich expresní profily Pokroky v Mikrobiologii MBÚ 2006

Kinetika exprese vybraných proteinů podílejících se na biosyntéze chlortetracyklinu Mycelium S. aureofaciens vyrostlé v chlortetracyklin produkčním mediu bylo pulzně značeno 35 S-metioninem. Grafy znázorňují relativní rychlosti syntézy jednotlivých proteinů vyjádřené jako poměr jejich koncentrace ke koncentraci EF-Tu v daném čase kultivace.

ppk - SCHEME OF THE WORK 48, 72 h Antibiotic production Morphology (SEM) 0, 15, 20, 25, 48, 72 h 1 Protein analysis (1D el) Protein analysis (2D el) ATP levels (luciferin-luciferase method) Antibiotic level analysis (TLC) 15, 20, 25, 48, 72 h 15, 25, 50, 72 h 2 15, 20, 25, 48, 72 h Protein labeling with 35 S methionin 50, 72 h

SET OF SELECTED PROTEINS ON 2D GELS WITH STAINED AND RADIOACTIVELY LABELED PROTEINS 72 h ppk - 72 h wt 50 h wt50 h ppk h wt h ppk h wt h ppk

Experimentální strategie - studium adaptivních mutací Kultivační profil  Vzorky o Resistence k erytromycinu o Zdatnost - Růstové křivky, doba zdvojení, velikost kolonií, CFU - Přesnost translace - Celková rychlost translace - Tu/proteiny celkem o 2D-elektroforéza - analýza proteinových profilů - MS identifikace proteinů

43 h 68 h 77 h103 h 43h 68h 77h 103h Proteinové profily u vybraných vzorků z kontrolního experimentu