Kolektiv autorů: Miroslav Pospíšil a Richard Novák Šlechtění lesních dřevin - izoenzymy ČZU - Fakulta lesnická a environmentální

Co jsou enzymy? ● Jedná se o jednoduché či složené bílkoviny ( proteiny ). ● Jejich hlavní funkcí je katalýza chemické přeměny v živých rostlinných a živočišných buňkách. ● Přičemž určují povahu i rychlost chemických reakcí a vytvářejí tak v živých organismech harmonickou souhru chemických funkcí. ● V současné době je známo více než 2000 různých druhů enzymů.

Struktura enzymů ● aminokyseliny – záporně nebo kladně nabité, příp. neutrální ● primární struktura – sekvence aminokyselin, určena geneticky ● sekundární a tercierní struktura (tvar molekuly) – ovlivněna velikostí molekuly, nábojem a stupněm hydrofility – udržována S-S můstky, H-můstky, iontovými a hydrofobními interakcemi ● kvartérní struktura – složení z více podjednotek, monomer až tetramer apod.

Podle reakcí, které ovlivňují svou katalytickou činností Podle reakcí, které ovlivňují svou katalytickou činností ●Oxidoreduktasy - reakce při níž je jedna látka oxidována a druhá redukována ●Transfery - reakce při níž je přenášena skupina obsahující uhlík, dusík, fosfor nebo síru z jednoho substrátu na jiný. ● Hydrolasy - katalyzují hydrolitické štěpení substrátu. ● Lyasy - štěpí vazbu C-C, C-O, C-N ● Isomerasy - přestavby skupin uvnitř molekuly (geometrické struktury) ● Lygasy - dochází ke spojení dvou molekul substrátu za současného využití energie ATP či jiných zdrojů Klasifikace enzymů

Co jsou izoenzymy? ● Polymorfní molekulární formy enzymů ● Enzymy se stejnou funkcí v metabolismu, katalyzující stejnou reakci. ● Lišící se (primární) strukturou. ● Tvorba izoenzymů je geneticky podmíněna. ● Závislé na stádiu ontogeneze.

Způsoby zkoumání izoenzymů a) Extrakcí b) Elektroforézou – separací (odlišnou pohyblivostí jednotlivých izoenzymů v elektrickém poli) zaznamenávání proteinů na substrátu gelu c) Detekcí - zaznamenávání proteinů na substrátu gelu

a) Extrakce Zdroje získání: ● z čerstvého materiálu (např. pupen) ● pomocí homogenizace s extrakčním pufrem ● centrifugací ( k získání čisté vrstvy DNA ) ● supernatant můžeme zmrazit na ( –70 °C ) a uchovat

b) Metoda elektroforézy ● rozdělení molekul podle jejich pohyblivosti v elektrickém poli. ● dochází k pohybu molekul k anodě, která je zde kladně nabitá ● rychlost pohybu závisí na: ● velikosti a tvaru molekuly. ● náboji molekuly. ● je velmi citlivá – rozeznává i stejné molekuly lišící se pouze o jednotkový náboj, který je patrný na elektroforetickém zařízení a zymogramu.

● vertikální – na polyakrylamidovém gelu ● horizontální – na škrobovém gelu

c) Detekce ● v případě, že na gelu není nic vidět. Potom je možno nespecificky obarvit všechny proteiny. ● enzymovou aktivitu lze zaznamenat např. specifickým barvením, které je založené na reakci, kterou enzym katalyzuje. ● různé typy detekce proteinů: ● produkt je barevný – v místě enzymu se objeví barevný pruh ● substrát je barevný – v místě enzymu gel ztratí svoji barvu, odbarví se.

Příklady detekce enzymu LAPSOD

Na gelu je patrné: ● zymogram – obrazec proužků na gelu ● proužky izoenzymů – zóny enzymatické aktivity (patterny) ● předpoklady interpretace: ● rozdílná pohyblivost odráží rozdíly v DNA (rozdíl je dědičný) ● komigrující ( jdoucí přímo pospolu ) proužky jsou homologní ● kodominantní exprese ● odlišíme homozygoty od heterozygotů ● znalost kvartérní struktury enzymů ( tvar molekuly, která ovlivňuje rychlost enzymu v elektroforezním poli ).

Vyhodnocení a interpretace izoenzymových dat Prosté porovnání pattern proužků ● naprosto shodná – identifikace klonů A B B C D E D

Alelická interpretace izoenzymů 1.zjistit počet lokusů různé lokusy – izoenzymy např. z různých složek buňky (cytosol, chloroplast apod.) 2.zjistit počet alel v lokusu kodominance tvarová struktura ploidie organismu allozymy izoenzymy izoenzymy – katalyzují stejnou reakci allozymy – produkty (alely) jednoho genu

Výhody analýzy izoenzymů ● rychlá metoda – možno analyzovat mnoho individuí najednou ● levná technika (n. v porovnání s DNA technikami) ● srovnatelná data mezi různými studiemi ● snadná interpretace výsledků ● nižší nutná kvalifikovanost, než u gen.markerů ● malá mutační rychlost (výhoda oproti např. mikrosatelitům) /lokus*rok

 Nevýhody ● potřeba čerstvého materiálu ● omezená variabilita – málo alel v lokusu – často jen 2-4 ● s porovnaním gen. markerů (přes 2000): málo izoenzymů(40) a jen 20 je jich dostupných na levných postupech ● variabilita v kodující části genomu – podléhá selekčnímu tlaku, a proto jsou lokusy často monomorfní

Možnosti využití izoenzymů ● identifikace klonů ● porovnání pattern (sloupce) na zymogramu ● populační úroveň - populační genetika ( určující především pro genetickou charakteristiku populace) … ● certifikace a identifikace vzorků semen ● studium genetické efektivnosti semenných plantáží ● pomůcka v selekci ekonomicky důležitých znaků ● Teoretické: -fylogenetické vztahy ● vhodná metoda maximálně na druhové úrovni -stanovení genetické variability a charakteru sprášení přirozených a šlechtitelských populací

Použité materiály Literatura ● Fér (2005): Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin Internetové odkazy