MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA NEUROFIBROMATÓZ Kratochvílová A.1, Blatná A.2,Kadlecová J.1, Ravčuková B.1, Valášková I.1 a Gaillyová R.1 1 FN Brno, Pracoviště dětské medicíny, oddělení lékařské genetiky,Černopolní 9,Brno; 2Masarykova Universita, Přírodovědecká fakulta, Brno

NEUROFIBROMATÓZA TYPU 1 - (periferiální neurofibromatóza; Von Recklinghausenova choroba) - 1:3000 - riziko vzniku malignit - velmi variabilní klinické projevy Diagnostická kritéria (dvě nebo více musí být přítomna ke stanovení diagnózy NF1) 1. Šest nebo více café-au-lait skvrn s průměrem větším než 5 mm před pubertou nebo 15 mm po pubertě 2. Dva nebo více neurofibromů nebo jeden plexiformní neurofibrom 3. Pigmentace v oblasti podpaží nebo třísel 4. Optické gliomy 5. Dva nebo více Lishových nodulů 6. Anomálie skeletu (dysplasie, pseudoarthrosa) 7. Příbuzný prvního stupně s diagnostikovanou NF1 (Gutmann, D.H. et al; 1997)

NEUROFIBROMIN - 2818 aa - 327 kDa. - exprimován v neuronech, oligodendrocytech a Schwannových buňkách, přítomen v leukocytech a mnoha dalších typech buňek. - obsahuje 360-ti aminokyselinovou oblast (kódovanou exony 21 - 27) s homologií ke katalytické doméně savčích GTPázy aktivujících proteinů (GAP) a k produktům kvasinkových genů IRA1 a IRA2. Tato oblast - „GAP related“ doména (GRD) - slouží k urychlení GTP-hydrolyzační aktivity a tím k inaktivaci p21-ras. „GAP Related“ doména neurofibrominu

Neurofibromin funguje jako akcelerátor konverze aktivního (GTP-vázaného ras) na inaktivní (GDP-vázaný ras) pomocí GTP hydrolýzy. Se stoupající expresí neurofibrominu klesá množství aktivního ras a je redukována mitogenní signalizace ke stimulaci buněčného růstu. V tumorech pacientů s NF1 jsou obě alely genu funkčně inaktivovány, rasGAP aktivita neurofibrominu je tedy ztracena. Tato ztráta vede ke zvýšení hladiny aktivovaného ras a k zvětšenému buněčnému růstu. Funkce neurofibrominu (Gutmann, D.H.; 2001)

GEN NF1 - 17q11.2 - 350kb genomické DNA - 60 exonů - kóduje 11 - 13 kb dlouhou mRNA - alternativní transkripty: 4 (více?) izoformy produkované alternativní sestřihem . exony genu NF1

MUTACE - jedna z nejvyšších mutačních rychlostí popsaných u lidské choroby: ~1x10-4/gametu/generaci - 50% případů NF1 je způsobeno de novo mutacemi - široké spektrum mutací: velké delece, malé delece, inzerce, indels, missence a nonsense mutace, sestřihové mutace rozložení mutací v genu NF1

PROBLÉMY MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKY NF1 - obtížné klinické stanovení diagnózy NF1 - vysoká mutační rychlost genu NF1 přibližně 50% případů reprezentuje de novo mutace - velikost genu - absence hot spot oblastí nutnost vyhledávání mutací v celém genu - nejasná korelace mezi typem mutace a fenotypem choroby - známa funkce pouze u centrální domény neurofibrominu - rozdílné klinické manifestace dokonce i mezi členy jedné rodiny

NAŠE STRATEGIE MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKY NF1 DNA z krve, AMC nepřímá (vazebná) analýza přenos patologické alely v rodině přímá analýza (DGGE, SSCP) vyhledává exony, které pravděpodobně nesou mutaci či jinou změnu v sekvenci SEKVENACE potvrzení diagnózy a přesná charakterizace mutace RNA z krve, tkáně přímá analýza (cDNA-SSCP) vyhledává úseky cDNA, které pravděpodobně nesou mutaci či jinou změnu v sekvenci

NEPŘÍMÁ DNA ANALÝZA GENU NF1 - rodiny se dvěma a více členy s klin. potvrzenou NF1 - určuje se přenos patologické alely genu „označené“ intragenovými polymorfními místy v rodině, nemůže potvrdit ani vyvrátit klinickou diagnózu - má význam pro určení rizika členů rodiny, u kterých se dosud neprojevily klinické příznaky a pro prenatální diagnostiku 173 400 I. II. III. 1 2 179 181 202 210 396 204 206 185 neurofibromatóza typu 1 je v rodině asociována s alelou označenou polymorfními markery o délkách: 173 bp (IVS38GT) - 204 bp (IVS27AC) - 400 bp (i27b)

PŘÍMÁ DNA ANALÝZA GENU NF1 - založena na skrínovacích metodách SSCP (jednořetězcový konformační polymorfismus) a DGGE (denaturační gradientová gelová elektroforéza). Skrínujeme 8 exonů genu NF1: exon 6, 12b, 16, 28, 29, 30, 31 a 37. DGGE Přítomnost mutace ovlivňuje mobilitu heteroduplexu mt+wt a homoduplexu mt+mt oproti homoduplexu wt+wt SSCP Mutace ovlivňuje sekundární strukturu jednořetězce a tím i jeho mobilitu. DGGE analýza exonu 31 7.5% PAG(37,5:1), 10% - 40% deaturantu, 150V/ 3,5 h / 60oC dráha 1 - 2: NF1 pacienti (C5839T)/non mt dráha 3 - 4: zdraví členové rodiny směr elektroforézy stoupající koncentrace denaturantu 1 2 3 SSCP analýza exonu 29 12% PAG(40:1), 150V/16h/10o C dráha 1 -2: standard DNA, dráha 3: NF1 pacient (C5242T)/non mt mt řetězec 1 2 3 4

RNA DIAGNOSTIKA GENU NF1 + detekce mutací v cDNA, umožňuje skrínovat celou kódující oblast genu. + detekuje i sestřihové mutace + manipulace „pouze“ s 20 fragmenty cDNA (každý fragment obsahuje přepis několika exonů) - práce s RNA je náročnější (RNA je náchylnější k degradaci) - obtížnější manipulace s delšími fragmenty cDNA - nejasný původ některých sestřihových změn RNA RT cDNA PCR NF1 cDNA (60 exonů) P1+PI P3+PIII P5+PV P7+PVII P9+PIX P2+PII P4+PIV P6+PVI P8+PVIII P10+PX cDNA-SSCP SEKVENACE

ZÁVĚR - NF1 Široké spektrum popsaných mutací (asi 500), počet exonů, vysoká mutační rychlost a absence výraznějších hot spot oblastí genu NF1 jsou důvodem, proč je naší snahou přejít od částečné DNA diagnostiky genu NF1 (8 exonů z 60, mutace nalezena u 18 ze 138 vyšetřených probandů) ke komplexnějšímu skríningu genu. Proto jsme vypracovali postup pro RNA diagnostiku genu NF1, která umožňuje vyhledávat mutace v celé vnitřní kódující oblasti genu. Změna elektroforetické mobility byla touto metodou nalezena u 10 z 18 pacientů, u 2 z nich byla tato změna popsána jako mutace, u ostatních bude důležité dořešit, zda tyto změny (sestřihy konstitutivních exonů) jsou mutacemi, nebo pouze sestřihovými izoformami přítomnými u i u zdravých kontrol (Vandenbroucke et al; 2001) a nebo vznikají až in vitro enviromentálně indukovaným aberantním sestřihem (Thomson et Wallace; 2002). Tento problém se v současnosti snažíme vyřešit pomocí kvantitativní PCR na Light cycleru. K odlišení chorobu způsobujících mutací od alelických variant bez efektu na fenotyp budeme v nejbližší době zavádět funkční analýzu (FASAY) genu NF1. Tato práce je podporována grantem IGA MZČR NM7627-3

NEUROFIBROMATÓZA TYPU 2 - vyskytuje se s četností 1:40 000 - těžká (Wishartova) forma má časný nástup a rychlý průběh - mírná (Gardnerova) forma má pozdější nástup a významně benignější průběh - projevy NF2 jsou obvykle u členů jedné rodiny podobné, ale byly popsány rodiny se současným výskytem těžké i mírné formy Pacienti s následujícími klinickými projevy by měli být sledováni na NF2 (předpokládaná nebo pravděpodobná NF2) Unilaterální VS v<30 letech, + nejméně jeden z dalších příznaků: meningiom, gliom, schwannom, juvenilní subcapsulární lenticulární opacity/juvenilní katarakta Vícečetné meningiomy (dva nebo více) plus unilatelární VS v <30 letech, nebo jakýkoliv příznak z následujících: gliom, schwannom, juvenilní subcapsulární lenticulární opacity/juvenilní corticální cataracta ( Diagnostická kritéria (potvrzení NF2) Bilaterální vestibulární schwannomy (VS) nebo Rodinná historie NF2 (příbuzný prvního stupně) plus: Jednostranný VS v<30 letech, nebo jakékoliv dva příznaky z následujících: meningiom, gliom, schwannom, juvenilní subcapsulární lenticulární opacity/juvenilní katarakta (Gutmann, D.H. et al; 1997)

GEN NF2 MUTACE V GENU NF2 - 22q12 - 120 kb genomické DNA - 17 exonů - 2255 bp dlouhá mRNA . MUTACE V GENU NF2 Významnější hot spot oblasti NF2 mutací dosud nebyly popsány. Většina zárodečných mutací jsou „nonsense“, posunové nebo sestřihové mutace, které mají za následek vznik proteinu se změněnou nebo chybějící C-terminální doménou. Hledání vztahu mezi genotypem a fenotypem NF2 objevilo souvislost mezi mutacemi generujícími zkrácený protein a vážností choroby. Exony genu NF2 mutace v genu NF2

MERLIN (SCHWANNOMIN) - produkt genu NF2, nejblíže příbuzný k ezrin, radixin, moesin (ERM) proteinům. - obsahuje N-terminální doménu, která zřejmě zprostředkovává vazbu ke glykoproteinům buněčného povrchu, -helikální doménu a unikátní C-terminus, který neobsahuje obvyklou aktin-vázající oblast, přítomnou u ostatních ERM proteinů. - existuje ve dvou konformacích: zavřené (růstový supresor) a otevřené (inaktivní). Změny těchto konformací mohou být způsobeny fosforylací merlinu, interakcemi s jinými proteiny nebo specifickými mutacemi. - může regulovat buněčný růst a motilitu růst podporujícími nebo zastavujícími signály iniciovanými aktivací CD44 a HGF-R (hepatocyte growth factor receptor). struktura merlinu a jeho interakce

MUTAČNÍ ANALÝZA GENU NF2 1. PCR syntéza všech 17 exonů 2. Srovnání klasické gelové SSCP s kapilárovou elektroforézou (CE-SSCP) na ABI PRISM 310 genetickém analyzátoru. Pomocí SSCP jsou mutace vyhledávány ve všech 17 exonech genu NF2. Srovnání výstupu z klasické a kapilárové SSCP exonu 13 genu NF2 3. Testování možnosti postupu přes RNA diagnostiku (cDNA-SSCP) - cDNA NF2 rozdělena do 6 překrývajících se úseků, které pokrývají téměř celou kódující oblast

zdravá kontrola, exon 13 exon 13 kontrola, 5% GSpolymer + 10% glycerol 30°C exon 13 mt, 3% GSpolymer + 6% glycerol 40°C exon 13 mt, 3% GSpolymer + 6% glycerol 35°C exon 13 mt, 5% GSpolymer + 10% glycerol 30°C exon 13 mt, 3% GSpolymer + 6% glycerol 30°C

NF2 - ZÁVĚR Gen NF2 má poměrně nízký počet exonů - 17 (ve srovnání se 60 exony genu NF1) - a proto je možné vyhledávat mutace ve všech jeho exonech. Důležitou otázkou je, která z vyhledávacích metod - klasická SSCP nebo kapilárová SSCP, je pro diagnostiku NF2 vhodnější - z prvních výsledků se kapilárová SSCP jeví jako přesnější, citlivější a méně zatížená subjektivní chybou. V nejbližší době by měla být vypracována strategie také pro RNA diagnostiku neurofibromatózy typu 2 a v případě její použitelnosti by bylo nejvhodnější oba molekulárně - diagnostické přístupy kombinovat: u mutací nalezených na genomové úrovni ověřovat jejich vliv na přepis do RNA, u změn nalezených na RNA (cDNA) ověřovat jejich genomovou podstatu.

MOŽNÉ CÍLE PRO TERAPII NEUROFIBROMATÓZ neurofibromatóza 1 neurofibromatóza 2 a b c d a) blokování enzymů zapojených do farnesylace ras (bez posttranslační modifikace zahrunující farnesylaci sekvence CAAX není možná lokalizace ras v membráně a inicializace signalizace) b - d) blokování dalších cílů aktivovaných proteinem ras pro amplifikaci mitogenního signálu - zavedení diagnostiky neurofibromatózy typu 2 na našem pracovišti Potenciální terapie NF2 by mohly být zamířeny na CD44 nebo HGF signalizační dráhy nebo na další molekuly zapojené do řízení změn v cytoskeletonu.