A n t i b i o t i k a Jednoduchý fenomén. Komplikovaný problém. Obtížné řešení.

Answer on a professional level ! Leaflet of the Alliance for prudent use of antibiotics Answer on a professional level !

Mikrobiologie antibiotik Antimikrobní látky Klasifikace antibiotik Standardizace metod Vyšetření citlivosti Disková metoda Diluční - MIC Interpretace Mechanismus účinku Resistence Resistence přirozená Resistence získaná Způsob přenosu Mechanismus resistence Modifikace cílové struktury Inaktivace antibiotika Jiné Genetika resistence Problémy resistence

Mikrobiologie antibiotik Antimikrobní látky Klasifikace antibiotik Standardizace metod Vyšetření citlivosti Disková metoda Diluční - MIC Interpretace Mechanismus účinku Resistence Resistence přirozená Resistence získaná Způsob přenosu Mechanismus resistence Modifikace cílové struktury Inaktivace antibiotika Jiné Genetika resistence Problémy resistence

Účinek antibiotik Selektivní aktivita Zástava množení vs. usmrcení Kinetika účinku Postantibiotický účinek

Účinek antibiotik Účinek b-laktamu na růst populace

Účinek antibiotik Účinek aminoglykosidu na růst populace

Mikrobiologie antibiotik Antimikrobní látky Klasifikace antibiotik Standardizace metod Vyšetření citlivosti Disková metoda Diluční - MIC Interpretace Mechanismus účinku Resistence Resistence přirozená Resistence získaná Způsob přenosu Mechanismus resistence Modifikace cílové struktury Inaktivace antibiotika Jiné Genetika resistence Problémy resistence

Vyšetření diskovou metodou Postup provedení diskového testu

Vyšetření diskovou metodou Podmínky pro správné provedení diskového testu - složení media - počet disků na plotně - pH media - inkubační teplota - hloubka agaru - složení inkubační atmosféry - inokulace - doba inkubace -koncentrace atb v disku - způsob měření zony

Vyšetření diskovou metodou Měření průměru zony a interpretace naměřené hodnoty

Automatické měření zon Zony se měří podle optimální hranice. Každá zona se automaticky hodnotí citlivý/resistentní. Výsledek se zapíše do souborů protokolu a dále zpracuje ve zprávě lékaři

Vyšetření diskovou metodou Měření neostré zony Povlak uvnitř zony Měření zony prosté kolonií

Vyšetření diskovou metodou Kolonie uvnitř zony. Heteroresistentní ORSA (MRSA) (Oxacilin resistentní S.aureus)

Gradientová difusní metoda - E-test Eliptická inhibiční zona končí u minimální inhibiční koncentrace na proužku obsahujícím gradient koncentrace antibiotika

Vyšetření diluční metodou Vzestupné ředění antibiotika v bujonu ve sloupcích. Po naočkováni a inkubaci Positivně hodnocené zkalení - růst Negativně hodnocené zkalení – slabý růst

Vyšetření diluční metodou Odečet MIC

Interpretace hodnot

Vztah průměru zony a MIC V praxi nelze určit MIC z průměru zony ! !

Selektivní volba antibiotik

Interpretace výsledku vyšetření Pokud je výsledek místně neobvyklý, je nutno vyšetření opakovat. Obvyklost nálezu záleží na resistenci populace v danné lokalitě Výsledky které je nutno ověřovat : S.aureus oxar Enterococcus spp. stm HLR (z jinak sterilního místa) S.pneumoniae penr , cef IIIr viridující Streptococcus. spp. penr nebo peni Klebsiella spp. nebo E.coli ESBL Enterobacteriaceae cipr

Interpretace výsledku vyšetření Pokud je výsledek místně neobvyklý, je nutno vyšetření opakovat. Výsledky terapeuticky i epidemiologicky závažné Při první izolaci je nutno ověřovat výsledky : S.aureus vanr, i Enterococcus faecalis penr, ampr Enterococcus faecium quinr Enterobacteriaceae amir Stenotrophomonas maltophilia cotr Haemophilus influenzae ampr + b-laktamáza neg amp/clavr, cef IIIr Enterobacteriaceae imi r, i

Mikrobiologie antibiotik Antimikrobní látky Klasifikace antibiotik Standardizace metod Vyšetření citlivosti Disková metoda Diluční - MIC Interpretace Mechanismus účinku Resistence Resistence přirozená Resistence získaná Způsob přenosu Mechanismus resistence Modifikace cílové struktury Inaktivace antibiotika Jiné Genetika resistence Problémy resistence

Atb - mechanismus účinku

Atb - mechanismus účinku Inhibice syntézy buněčné stěny Inhibice of proteosyntésy Inhibice syntézy nukleových kyselin Destrukce buněčné mebrány

Atb - mechanismus účinku Inhibice syntézy buněčné stěny b-laktamy, glykopeptidy, bacitracin, fosfomycin Inhibice of proteosyntézy tetracykliny, chloramfenikol, aminoglykosidy linkosamidy, fusidová kyselina Inhibice syntézy nukleových kyselin sulfonamidy, chinolony, nitroimidazoly, nitrofurany,

b-laktamy - účinek u Gram negativů b-laktamy vstupují poriny, vážou se na PBP a blokují jejich enzymovou funkci. Stěna bakterie je defektní a buňka lyzuje

b-laktamy - účinek u Gram pozitivů Grampozitivy nemají poriny; b-laktamy vstupují difuzí mureinem, vážou se na PBP a blokují jejich enzymovou funkci. Stěna bakterie je defektní a buňka lyzuje

Linkosamidy Makrolidy a linkosamidy se vážou na 50S ribosomy, způsobují terminaci polypeptidového řetězce a tím inhibici syntézy bílkovin.

Účinek aminoglykosidů inhibice proteosyntézy na ribosomu chybné čtení mRNA

Fluorochinolony inhibují syntézu DNA DNA gyráza se váže na DNA a odděluje dvojprovazcové úseky; molekula DNA se rozplétá. Fluorochinolony se vážou na komplex gyráza/DNA a DNA se láme.

Polymyxin rozrušuje cytoplasmatickou membránu Molekuly polymyxinu prostupují vnější membránou a mureinovou vrstvou. Destabilizují cytoplasmatickou membránu, cytoplasma uniká a buňka hyne

Mikrobiologie antibiotik Antimikrobní látky Klasifikace antibiotik Standardizace metod Vyšetření citlivosti Disková metoda Diluční - MIC Interpretace Mechanismus účinku Resistence Resistence přirozená Resistence získaná Způsob přenosu Mechanismus resistence Modifikace cílové struktury Inaktivace antibiotika Jiné Genetika resistence Problémy resistence

Resistence Přirozená resistence Získaná Mutace genu na chromozomu Přenos extrachromozomálního elementu

Přirozená resistence Přirozená resistence Nepřístupnost cílové struktury impermeabilita (amg resistence striktních anaerobů) Nespecifický efflux systém multiresistence Inaktivace cefalosporináza AmpC Klebsiella pneumoniae

Rozvoj resistence populace. Získaná resistence Rozvoj resistence populace. Pomnožení resistentních buněk v populaci citlivých buněk po selekci antibiotikem.

Chromozomální resistence Získaná resistence Chromozomální resistence Modifikace cílové struktury Stm resistence: mutace rDNA genů resistence k b-laktamům : PBP Snížená permeabilita Metabolický bypass Tmp:nadprodukce of DHF reduktázy Dereprese efflux systemu multirestence

Mikrobiologie antibiotik Antimikrobní látky Klasifikace antibiotik Standardizace metod Vyšetření citlivosti Disková metoda Diluční - MIC Interpretace Mechanismus účinku Resistence Resistence přirozená Resistence získaná Způsob přenosu Mechanismus resistence Modifikace cílové struktury Inaktivace antibiotika Jiné Genetika resistence Problémy resistence

Získaná resistence - porin Gramnegativní bakterie mohou získat resistenci vznikem permeabilitní bariery alterací porinu. Molekuly b-laktamů nemohou proniknout k PBP.

Získaná resistence - eflux Efflux; kanálek ve stěně aktivně exportuje tetracyklin a jiné látky stejnou rychlostí, jíž pronikají dovnitř (difuzí, transportem).

Získaná resistence - konjugace Přenos genů resistence konjugací

Extrachromozomální resistence Získaná resistence Extrachromozomální resistence Inaktivace b-laktamázy, enzymy modifikující amg, acetyltransferázy cmp resistence k b-laktamům : PBP Efflux systémy Tet efflux Modifikace cílové struktury Ery: metyláza / 23S RNA (50S ribosom)

Modifikace cílové struktury b-laktamy Alterované bílkoviny stěny Nízká afinita PBPs Vankomycin Alterované peptidy - prekursory buněčné stěny Chinolony Alterovaná DNA gyráza Aminoglykosidy Alterované ribosomové bílkoviny Trimetoprim Nová dihydrofolát reduktáza resistentní k tmp

Modifikující enzymy b-laktamy b-laktamázy (peniciliny, cefalosporiny, karbapenemy, monobaktamy) Aminoglykosidy acetyltransferáza, fosfotransferáza, nukleotidyltransferáza Chloramfenikol chloramfenikol acetyltransferáza

Modifikující enzymy - amg Výskyt profilu amg multiresistence profil /výskyt gen tob ami častý R S neobvyklý vzácný nepravděpodobný

Modifikace cílové struktury Molekuly b-laktamů pronikají do buňky. Pro alteraci PBP se nevážou, buňka je resistentní. Resistence tohoto typu se vyskytuje u Gram-pozitivů i negativů.

Modifikující enzymy- b-laktamáza b-laktamáza grampozitivních bakterií se vylučuje do prostředí; b-laktamy jsou inaktivovány extracelulárně

Modifikující enzymy b-laktamáza gramnegativních bakterií se hromadí v periplas-movém prostoru; b-laktamy jsou inaktivovány intracelulár-ně po vniknutí do buňky

Mikrobiologie antibiotik Antimikrobní látky Klasifikace antibiotik Standardizace metod Vyšetření citlivosti Disková metoda Diluční - MIC Interpretace Mechanismus účinku Resistence Resistence přirozená Resistence získaná Způsob přenosu Mechanismus resistence Modifikace cílové struktury Inaktivace antibiotika Jiné Genetika resistence Problémy resistence

Získaná resistence - genetika Chromozomální mutace Mobilita genů – výměna genů mezi kmeny (různých species, rodů, a čeledí) Plasmidy přenosné geny mnohočetné resistence : konjugace, transformace, transdukce Transposony “jumping genes “mezi chromosomem a plasmidem Indukce exprese latentních genů resistence inducibilních b-laktamáz

Získaná resistence - mutací b-laktamy, aminoglykosidy, makrolidy, chloramfenikol, tetracycliny, chinolony, sulfonamidy, kyselina fusidová, fosfomycin, rifampicin.

Získaná resistence – mobilita genů Rekombinační mechanismus 1. Klasická rekombinace Rec-A; nutná genetická homologie (např. pbp genová mozaika S.pneumoniae, N.gonorrhoeae) 2. Transposice; transposon; není nutná homologie mezi rekombinačními sekvencemi 3. Specifická rekombinace; rekombinace mezi krátkými homologními sekvencemi - lokálně specifickým (site specific) enzymem integron; genová kazeta (gene casette)

Získaná resistence – transposon . Získaná resistence – transposon Transposon (Tn) mobilní sekvence přenáší se z jedné molekuly DNA na druhou (donor / recipient) samostatně se nereplikuje inserční sekvence - rozpoznávací místo pro transpozázu - koncové opakovací sekvence (terminal repeats) nese geny které nesouvisí s transpozicí: geny atb resistence geny pro produkci toxin fermentaci laktosy etc

Struktura transposonu Transposon T3 res resolution site tnpA transpozáza tnpR resolváza bla b-laktamáza Dr 5 párů bazí přímého opakování direct repeat IR 38 párů bazí obráceného opakování inverted repeats

Transposony gramnegativů velikost (kbp) koduje resistenci Tn1 5.0 ampicilin Tn2 5.0 ampicilin Tn3 5.0 ampicilin Tn5 5.1 kanamycin Tn7 14.0 streptomycin, trimethoprim Tn9 2.7 chloramfenikol Tnl0 9.3 zetracyklin Tn21 19.0 streptomycin, sulfonamides Tn1721 11.2 tetracyklin

Transposony grampositivů velikost (kbp) koduje resistenci stafylokoky: Tn551 5.3 MLS group Tn552 6.1 penicilin Tn554` 6.7 MLS group, spectinomycin Tn4001 4.7 gentamicin, trimethoprim, kanamycin Tn4002 6.7 penicilin Tn4003 3.6 trimethoprim Tn4201 6.6 penicilin enterokoky: Tn1546 10.8 glykopeptidy

Záchyt genů (gene capture) Integron Diskretní gen s attI site attI 1. Rekombinační místo 2. Gen pro integrázu Genová kazeta cirkulární, nereplikuje se původně lineární část chromosomu nebo plasmidu obsahuje jediný gen 59e rekombinční místo 59 bazí

Počátky rozvoje resistence Návrat