Nabil Ahmed GHALIB نبيل احمد غالب Anatomický ústav, oddělení neroanatomie, lékařská fakulta Masarykovy Uniuverzity v Brně

ÚVOD Poranění periferních nervů je stále jen částečně vyřešeným problémem rekonstrukční neurochirurgie. Přes zlepšení výsledků regenerace po zavedení mikrochirurgické operační techniky je v mnoha případech reinervace stále vzdálena od optima. Zlepšení výsledků funkční reinervace po rekonstrukci periferního nervu dalším zdokonalováním chirurgické techniky je však málo pravděpodobné. Proto se pozornost zaměřuje na roli různých trofických a tropických faktorů, adhezivních molekul, a elementů extracelulární matrix.

CÍL PRÁCE Cílem předložené práce je sledovat preferenční vliv celulárních a extracelulárních faktorů na regeneraci a maturaci motorických axonů.

MATERIÁL A METODIKA Experimenty byly provedeny na 46 laboratorních potkanech linie Wistar. Zvířata byla rozdělena na 3 skupiny: experimenty regenerace motorických axonů do čerstvě připravených celulárních štěpů ze svalového a kožního nervu (n=12)(14d). 2) experimenty regenerace motorických axonů do acelulárních nervových štěpů připravených ze svalového a kožního nervu (n=24) (1a 2 m). 3) kontrolní skupina (n=10).

Schematické znázornění provedení exp. U 1.skupiny NF-P NF-L n=6 S M M S NF-P NF-L n=6 S M M S NF-L: levý n.femoralis NF-P: pravý n.femoralis, S. n.saphenus, M: svalová větev n.femoralis,

Schematické znázornění provedení exp. U 2. skupiny NF-P NF-L S M M S NF-L: levý n.femoralis NF-P: pravý n.femoralis, S. n.saphenus, M: svalová větev n.femoralis

Schematické znázornění provedení retrográdního obarvení motoneuronů Spinální mícha MN MN NF-P NF-L n=4 1m n=4 2m n=4 intaktní MŠ KŠ S FE FR S M M NF-L: levý n.femoralis NF-P: pravý n.femoralis, S. n.saphenus, M: svalová větev n.femoralis, MŚ: motorický štěp, KŚ: kožní nervovýštěp MN: motoneuron, FE: Flouro-Emerald, FR: Flouro-Ruby

VÝSLEDKY Svalový nerv. štěp Kožní nerv. štěp 1 2 14d 3 4

Průměr tloušťky myelinu  SD Výsledky morfometrické analýzy regenerovaných myelinizovaných axonů přes čerstvě připravené štěpy ze svalové a kožní větve n .femoralis. n Průměrný počet axonů  SD Průměr axonů  SD (m) Průměr tloušťky myelinu  SD Intaktní svalová větev 6 701  1 01 4.2  0.7 1.6  0.3 Čerstvý štěp ze svalového nervu 456  84* 2.5  0.9* 1.0  0.2* štěp z kožního 415  81* 1.2  0.5*† 0.5  0.2*† *Statistický významný rozdíl (p < 0.05) při srovnání s hodnotou v intaktní svalové větvi n. femoralis † Statistický významný rozdíl (p < 0.05) při srovnání s hodnotou štěpu ze svalové větve n. femoralis

Acelulární štěpy Svalový nerv. štěp Kožní nerv. štěp 5 6 1m 7 8

9 10 11 Motoneurony retrográdně označené FE Přes štěp ze svalového nervu Motoneurony retrográdně označené FR přes štěp z kožního nervu 9 10 11

Počty retrográdně označených motoneuronů odpovidajících intaktní svalové větvi n. femoralis a svalové větvi n. femoralis po aplikaci FR a FE distálně od svalového a kožního nervového štěpu. n Průměrný počet motoneuronů ± SE Intaktní svalová větev 4 482 ± 37 Motorický nervový štěp 1měsíc 288 ± 48 Kožní nervový štěp 20 1 ± 19 2 měsíce 387 ± 47* 180 ± 50 *Statistický významný rozdíl (p<0,05) při srovnání s hodnotami u nervového štěpu z kožního nervu.

Výsledky morfometrické analýzy axonů regenerovaných do acelulárních štěpů připravených ze svalového a kožního nervu. n Průměrný počet axonů ± SD Průměrný průměr axonů ± SD (µm) Průměr tloušťky myelinu ± SD (µm) Štěp ze svalové větve n. femoralis 1 měsíc 8 548 ± 120 2.4 ± 0.7 0.9 ± 0.2 Štěp z kožního nervu 547 ± 101 2.4 ± 0.2 Štěp ze svalové větve n. femoralis 2 měsíce 812 ± 142*+ 2.8 ± 0.4*+ 1.2 ± 0.1*+ 379 ± 70** 2.4±0.3 0.9 ± 0.1 * statisticky významné rozdíly (p<0.01) při srovnání se štěpy ze svalového nervu 1 a 2 měsíce od jejich aplikace ** statisticky významné rozdíly (p<0.01) při srovnání se štěpy z kožního nervu 1 a 2 měsíce od jejich aplikace + statisticky významné rozdíly (p<0.01) při srovnání mezi oběma typy štěpů po dvou měsících od aplikace

Minifascikulizace a tvorba nového perineuria Intaktní svalová větev NF Intaktní kožní větev NF (n.saphenus) 12 13 Svalový nerv. štěp Kožní nerv. štěp 14 15

Svalový nerv. štěp Kožní nerv. štěp 1m 16 17 2m 18 19

20 21 23 22 K K Typické perineurium Atypické perineurium Kapilára ve štěpu ze svalového nervu Kapilára ve štěpu z kožního nervu 23 K K 22

Kolagenní fibrily 1m 24 25 2m 26 27 Svalový nerv. štěp Kožní nerv. štěp 1m 24 25 2m 26 27

ZÁVĚRY 1 počet regenerovaných axonů byl přibližně stejný v obou typech čerstvých štěpů byl zjištěn výrazně větší průměr regenerovaných motorických axonů a větší tloušťku jejich myelinu po jejich regeneraci v štěpu ze svalového než kožního nervu 14 dní po jejich aplikaci rozdíly v morfometrické charakteristice regenerovaných axonů, naznačují, že v buněčném a extracelulárním složení endoneuria kolem motorického a aferentního nervového vlákna existují určité rozdíly

ZÁVĚRY 2 s prodlužujícím se časem počet motoneuronů, které své axony regenerovaly do acelulárních štěpů ze svalového nervu se zvýšil počet motoneuronů, které své axony regenerovaly do acelulárních štěpů z kožního nervu se snížil počet a průměr regenerovaných motorických axonů, tloušťka jejich myelin a minifascikulizace byly vyšší v acelulárním štěpu ze svalového než z kožního nervu

ZÁVĚRY 3 kapiláry byly vždy oddělené od minifascikulů perineuriem jen v acelulárním štěpu ze svalového nervu s prodlužujícím se časem bylo pozorováno zmnožení kolagenních fibril jen ve štěpech z kožního nervu experimenty s  acelulárními nervovými štěpy potvrzují specifickou úlohu ECM pro regeneraci axonů různých typů nervových vláken periferního nervu

ZÁVĚRY 4 získané výsledky podávají důkaz toho, že používané kožní nervové štěpy nepředstavují vhodné řešení překonání nervových defektů samozřejmě v klinické praxi nelze použit štěpů ze svalových nervů, ale výsledky ukazují nutnost vývoje dalších alternativních metod pro zlepšení regenerace a funkční reinervace výsledky dávají podnět pro další výzkumu složení ECM a její vliv na zlepšení výsledků regenerace a funkční reinervace jak v PNS, tak v CNS

PODĚKOVÁNÍ Chtěl bych poděkovat prof. MUDr. L. Páčovi, CSc. za vytvoření optimálních podmínek pro moji práci prof. RNDr. P. Dubovému, CSc Za odborné vedení v průběhu aspirantury . D. Kutějové a J. Grégrovi za technickou pomoc při sestavování této dizertační práce. MUDr. I. Svíženské, CSc. a MUDr. I. Klusákové Za pomoci při jazykové opravy práce. Současně patří moje poděkování všem pracovníkům Anatomického ústavu, kteří mi byli jakýmkoliv způsobem při přípravě dizertační práce nápomoci. Předkládaná dizertační práce byla podporována grantem CEZ: J07/98:1411100001.