Molekulární hematologie nemaligní onemocnění Jozef Madžo Júlia Starková

Geneticky podmíněné hematologické onemocnění Thalasemie  molekulární patogeneze Srpkovitá anemie / sickle cell anaemia léčba ovlivněním exprese genů Hemofilie genová terapie

Poruchy v syntéze hemoglobinu Hemoglobinopatie Poruchy v syntéze hemoglobinu

struktura genů hemoglobinové rodiny     2 1  1 2 1 Chrom 16   G A      Chrom 11  2  2  2  2  2  2  2  2  2  2  2  2 Embryo Fétus Dospělý

Thalasemie  thalasemie  thalasemie 0 úplná ztráta chyba v produkci globinového řetězce Podle řetězce:  thalasemie  thalasemie   /  /  /     ... Z funkčního hlediska 0 úplná ztráta + částečná ztráta

 Thalasemie Poruchy v syntéze -globinového řetězce 0 thalasemie chyba v syntéze  řetězce snížená syntéza  řetězce defekt v transkripci  řetězce abnormální processing mRNA abnormální translace mRNA nestabilní - řetězec

-thalasemie - defekt v transkripci  řetězce * delece  globinového řetězce obecně málo časté fenotyp 0 1 výjimka 3`del: “Sind“ populace v Indii a Pákistánu 30% alel mutace v promotorové oblasti oblast –30nt (TATA box) res. -90 a –105 10 – 25% normálního množství -globinu zejména časté u africké populace fenotyp +

-thalasemie - abnormální processing mRNA * GT AG mutace na přechodu exon – intron: `5-GT ––– AG 3` porucha sestřihu mRNA fenotyp 0 thalasemie

-thalasemie-abnormální processing mRNA GT AG TTGGTCT A 10% 90% mutace v „splice site consensus sequence“ konsensní oblast okolo invariantních nukleotidů GT– AG odkrytí kryptických sestřihových míst fenotyp + thalasemie

-thalasemie - abnormálna translace mRNA AMK řetězec ribozom cap AAAAAAAA STOP AUG * * * mutace non-sense předčasné zavedení stop kodonu: kodon-17 Jižní Asie kodon-39 Středomoří mutace „frameshift“ posun čtecího rámce: +1 res. –1 NT fenotyp 0 thalasemie mutace v iniciačním kodonu redukují efektivitu translace fenotyp + thalasemie

-thalasemie - abnormální stabilita  globinu normální  globin modifikovaný  globin Pozměněná stabilita  globinu mutace na úrovni DNA substituce in-frame delece in-frame inzerce fenotyp + až 0 thalasemie

Výskyt SCD (Sickle Cell Disease) genová frekvence – 0,14 západní ekvatoriální Afrika – 0,1 Saudská Arábie a část Indie – 0,04 Jižní a Severní Amerika (USA 8% heterozygotů, 1 z 500 obyvatelů trpí onemocněním)

Dědičnost SCD SCD heterozygot heterozygot zdravý - normální alela kodominantní vztah alel  shodná frekvence u žen a mužů preference heterozygotů odolnost vůči malárii; Plasmodium falciparum SCD heterozygot heterozygot zdravý - normální alela - mutantní alela

Vyšetření mutace I.

Vyšetření mutace II.

6 globin: Glu Val O2 O2 HbS oxy HbS deoxy polymer

Patofyziologie SCD vytvoření polymerů HbS u deoxygenních erytrocytů formování srpkovitých buněk zvýšená adheze erytrocytů k endotelu abnormální kationtová homeostáza  buněčná dehydrace vasokonstrikce (via NO, endothelin-1)  prodloužení mikrovaskulárního tranzitu erytrocytů

Klinické projevy nedostatečné proudění krve v krevních cévách nedostatečné zásobování kyslíku v kostech, svalech, plících, mozku, srdci splenomegalie - infekční choroby bolesti končetín, acute chest syndrome, mozkové příhody

Terapie I. tranfúzní program transplantace kostní dřeně (~ 5% mortalita) blokátory iontových kanálů anti-adhezivní a protizánětlivá léčba (anti-P-selectin, inhibitor NFκB) inhalace NO genová terapie lentivirový konstrukt s βA-T87Q globinovým genem transdukován do HSC a transplantován dvěma myším  inhibice dehydratace a deformace erytrocytů, ústup splenomegalie a hypostenurie

Terapie II. Hydroxyurea cytotoxická látka; zvyšuje koncentraci HbF zvýšení množství HbF a F buněk inhibice kationtové deplece, adhezivity s endotelem nevýhody – velký počet non-respondentů, karcinogenní a leukemogenní efekt při dlouhodobé léčbě teratogenní účinek byl pozorován u zvířat

Metylace X DNMT transkripčne aktívní chromatín transkripčne neaktívní chromatín cytozín 5-metyl cytozín

X promotorová oblast γ-globínu u dospělého CGACGCGTTCGCCCGCG promotorová oblast γ-globínu po narození CGACGCGTTCGCCCGCG DNMT hypometylační látky DNA promotorová oblast γ-globínu u dospelého po podání hypometylačních látek CGACGCGTTCGCCCGCG

Terapie III. Hypometylační látky 5-azacytidine inkorporace do DNA a RNA, kovalentní vazba s DNA metyltransferasou (DNMT; udržuje metylační pattern během replikace) účinek: u paviánů 40-70 násobné zvýšení exprese γ-globinového genu; metylace γ-globinového promotoru snižuje koncentraci HbF (10-25%), F buňky (30-40%) 5-aza-2’-deoxycytidine(decitabine) inkorporace do DNA, účinnější než 5-azacytidin hypometylace γ-globinu; zvýšení acetylovaného H3 a H4 asociovaného s γ-globinovým promotorem

První studie na pacientech 8 pacientů léčených intravenózně decitabinem 2 týdny (5 pacientů nezvyšovalo hladiny HbF, 2 pacienti neodpovídali na léčbu HU a 1 nebyl léčený HU) 3,5% 13,5%HbF 21% 55% F buňky sledování toxicity 63 týdnů – bez toxických příznaků, výskyt neutropenie 8 pacientů léčených subkutánně decitabinem 6 týdnů (pacienti neodpovídali na léčbu HU) 6,5%20,4% HbF 38%71% F buňky

Poruchy v syntéze proteinů koagulační kaskády Koagulopatie Poruchy v syntéze proteinů koagulační kaskády

Hemofilie: genetický podklad Hemofilie (dědičná porucha v produkci koagulačního faktoru) Podtypy A: F – VIII. B: F- IX. Hemofilie A chromozóm X vázána porucha  Xq28 => častější výskyt u mužského pohlaví XhY => ženy přenašečky XhX F VIII produkován hlavně v játrech deficient F VIII-  hemofilie A za přítomnosti všech ostatních faktorů

Hemofilie A Queen Victoria Prince Albert Prince Heinrich von Battenberg Beatrice Gonzalo Alfonso v. Spanien Ruprecht Alexis Anastasia Olga Tatiana Maria Waldemar Sigismund v. Preussen Irene Frederick Alexandra Nikolaus II Alice Ludwig v. Hessen Leopold

Hemofilie A

anti-FVIII Ab resp. anti-FIX Ab Hemofilie: léčba 1 pokrok v ½ 20.stol. - Krevní infúze a produkty plazmy 80-tá léta HIV infekce => alternativní zdroje FVIII substituční terapie: moAB purifikovaný FVIII rekombinantní FVIII 3 – 20% pacientů s těžkou Hemofilií B a A Vznik inhibitoru anti-FVIII Ab resp. anti-FIX Ab

Hemofilie: léčba 2 rFVIIa NovoSeven® (Novo Nordisk) anti-FIX Ab FIIa rhFVIIa u pacientů s inhibitorem: anti-FVIII Ab anti-FIX Ab při příhodách  krátký poločas (2,7h) FIIa FII FXa/FVa FX FIXa/FVIIIa FIX FXI FVIIa/TF TFPI

Genová Terapie 1 ADA deficient SCID X-linked SCID Gaucher´s disease chronic granulomatous disease Fanconi´s anaemia HIV haemoglobinopathies haemophilia

Proč je hemofilie vhodná pro genovou terapii? Zvýšení hladiny faktoru >1% odstraní nejtěžší příznaky a vede ke snížení mortality faktor může být produkován širokým spektrem buněk široké „terapeutické okno“: 1.5% až 100% normálních hladin faktoru zvířecí modely (psi a myši) a myší a psí geny pro faktory VIII a IX k disposici jednoduché sledování výsledků léčby - laboratorní i klinické

Genová Terapie 2 Genová terapie - opravy defektního genu odpovědného za vývoj nemoci Typy dle provedení: normální gen je vložen na nespecifické místo v genomu. . výměna abnormálního genu homologní rekombinací.. oprava pomocí selektivní reverzní mutace, která vrací gen do normální funkce. nejběžnější

Genová Terapie 3 Ex vivo: In vivo: přímé podání fibroblasty DNA DNA selekce+expanze není pracné vhodné pro „highthroughput“ = komerční využití pracné pro provedení individuální přístup vyšší účinnost

Hemofilie: genová terapie - vektory Nevirové: „nahá“ DNA Virové: retroviry adenoviry AAV (adeno-asociované viry)

Genová terapie hemofilie do roku 2004 do konce roku 2003 v USA proběhlo 5 studií sponzorované biotechnologickými firmami, které vyvinuly vektor sponzor fáze n vektor hladina vedlejší efekt Chiron I. 13 retrovirus / iv 0-1% bez THT 6 Plazmid / omentum non-viral, fibroblasty do omenta 0-4% Avigen 9 AAV2 / i.m AAV2 / intrahepatic 3-12%  transamidasa Genstar 3 Adenovirus / iv specifická exprese v játrech  transamidasa trombocytopenia „Chinese Trial“ 2 transdukované fibroblasty do 6%

studie1: Chiron studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 13 s těžkou hemofilií A (HIV a HCV pozitivní) vektor: retrovirální (deletováná B doména hFVIII) podání: intravenózní infuze dávka: 3x107 - 9x108 vp/kg efekt: u žádného hladina FVIII ne z: <1% komentář: limitována kapacita retrovirálné integrace do nedělicích se buněk jater a nepřítomnost pro játra specifického promotoru ve vektoru

studie2: THT studie: fáze I. pacientů: 6 s hemofilií A vektor: plazmid elektroporovaný do autologních fibroblastů podání: injekce do omenta dávka: 100M – 400M buněk efekt: u 4 / 6 hladina FVIII z oproti původní až na 4% komentář: redukce užívaní rekomb./purif. faktoru a spontánního krvácení u všech pacientů po dobu 12 měsíců pokles: ? gene silencing, imunologický dozor „clerance“, zestárnutí „senescence“ reimplantovaných fibroblastů

studie3: Avigen I. studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 9 s hemofilií B vektor: AAV2 s hFIX cDNA podání: intramuskulární injekce dávka: nejnižší - 2x1011 vp/kg efekt: hladina z na 1-2% (neměnila se při  dávkách 10-90 injekcí) komentář: 50% redukce užívaní faktoru a spontánního krvácení po dobu 40 měsíců virus detekován ve všech tělesních tekutinách kromně spermatu neutralizační anti-AAV2 protilátky v závislosti na dávce viru

studie4: Avigen II. studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 6 s „těžkou“ hemofilií B (HCV pozitivní) vektor: AAV2 s hFIX cDNA podání: injekce do hepatální arterie dávka: 8x1010 – 2x1012 vp/kg efekt: hladina z do 2% (4pacienti - nízká a středních dávka) hladina z 3-12% (2pacienti - nízká a středních dávka) komentář: trvání 2-3 týdny dále po 6 týdnech pokles <1% dočasně pozastaveno virus detekován ve spermatu, nepotvrzen ve spermiích pokles FIX koreloval se vzestupem (9x) jaterní transaminasy

studie5: Genstar studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 3 s „těžkou“ hemofilií A vektor: oslabený („gutless“) adenovisus s hFVIII cDNA podání: intravenózní injekce dávka: nízké - vysoké efekt: bez signifikantního z hladiny (bez ohledu na dávku) komentář: u vysoké dávky vzestupem jaterní transaminasy a trombocytopenie

Genová terapie hemofilie do roku 2003 sponzor fáze n vector hladina vedlejší efekt Chiron fáze I 13 retrovirus / iv 0-1% bez THT 6 Plazmid / omentum non-viral, fibroblasty do omenta 0-4% Avigen 9 AAV2 / im AAV2 / intrahepatic 3-12%  transamidasa Genstar 3 Adenovirus / iv specifická exprese v játrech  transamidasa trombocytopenia „Chinese Trial“ 2 transdukované fibroblasty do 6% 420 dní ? 37+2 0-12% dočasně CELKEM: 37 (39) pacientů x imunitní odpověď +/- NÍZKÁ ÚČINNOST ...

Hemofilie: genová terapie Ano? – Ne? phase I/II klinické studie nebyla přerušena u žádného pacienta bez vzniku inhibitoru zvýšení hladin FVIII/FIX (nižší než u zvířecích modelů) - klinicky nesignifikantní Ekonomické kriterium Finančně dostupné pro rozvojové země Jen 20% pacientu má přístup k „high-tech“ terapii z ekonomicky rozvinutých zemí Možnost opravy porušených genů náhrada mutovaného úseku DNA za nemutovanú DNA nové nevirové vektory: DNA-RNA oligont. Zvířecí modely Zavedené modely vektory (i oslabené) vyvolávají zánětlivou reakci 1 úmrtí po podání Adenovirálního vektoru do hepatální artérie (zánětlivá reakce, horečka, respirační potíže  multiorgánové selhání Studie s „gutted“ Adenovir. V. zastavena po objevení: horeček, trombocytopenie (obnovena s nižšími dávkami) riziko vzniku malignity Náhodné chromozomální integrace: aktivace protoonkogenů / inaktivace tumor supresorů 2/10 případy leukémie „Phase I“klinické studie SCID retrovirální vektor integrován v blízkosti protoonkogenu LMO2 leden 2003 FDA pozastavilo všechny studie s retrovir. v. u krevních kmenových buněk „Primum non nocere“

Molekulární hematologie nemaligní onemocnění www.lf2.cuni.cz/clip Publikace prezentace > Výukové presentace

Trombofilní stavy

APC resistence CGA CAA R Q S prothrombin thrombin Faktor V Faktor Va Faktor Vi Proteolysa Proteolysa APC (gen) CGA CAA 1691 S (protein) R Q 506 familiární trombophilie

Detekce Leidenské mutace FV a genu pro prothrombin homozygot mutant homozygot wildtype Výsledek do 2 hodin od náběru... heterozygot