Problémy spojené s kultivací in vitro

rekalcitrance Nežádoucí a většinou ireverzibilní stav nastávající u kultur in vitro, kdy buňky, pletiva nebo orgány ustrnou ve vývoji i růstu a ač jsou živé, nereagují ani na změněné kultivační podmínky (recalcitro = přístup odpírám, vyhazuji – o koni).

Rekalcitrantní genotypy Příčiny jsou spatřovány v ekologické konstituci rostlinného materiálu (donora), manipulacích invitro a stresorech in vitro.Vážný problém v biotechnologii. Hypotéza: neexistují (jen zatím nevíme jak na to)

Symptomy in vitro 1. Atypická anatomie, morfologie a fyziologie - miniaturizace • změna stavby listů a jejich funkce (uzavřený prostor), pokožka s nízkým obsahem pektinu a celulózy, s nedostatečně vyvinutou kutikulou Nefunkční průduchy • opuchlé výhony • listy bledě zelené nebo šedomodré • listy podlouhlé nebo páskovité • křehké • krabacené nebo zkroucené

listy průsvitného (skelného) vzhledu - vitrifikace Sklovitý až průhledný vzhled Hyperhydricita pletiv a orgánů křehkost

http://www. hort. purdue http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT201/Lec/03-05-08TCProblems.pdf

Grigoriadou1, 2007

Etylén Oxid uhličitý Vodní páry Komponenty média (cytokininy, sacharóza, dusík) Vysoká teplota

Jak překonat? Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar) Změnit poměr amonia: nitrátu Snížit hladinu cytokininů na minimum ventilovat

Srovnání atmosféry Skleník in vitro kultura O2 21 % jen 4 % CO2 0.04 % až 20 % H2O 60-85 % 100 %

Jak překonat? Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar) Změnit poměr amonia: nitrátu Snížit hladinu cytokininů na minimum Ventilovat Zvýšit intenzitu světla (fotosyntézu) Snížit teplotu a vlhkost

2. Redukce apikální dominance Zkrácená internodia výhonků Růžicovitý růst shluky výhonů při mikropropagaci

Somaklonální variabilita Příčiny zvyšující SV: Dlouhá expozice fytohormony (!2,4-D) Dlouhé intervaly mezi subkulturami Větší riziko při tvorbě adventivních než při množení z axilárních pupenů (a meristémů) Rhododendron

3. Narušení tvorby kořenů nadměrná produkce adventivních kořenů špatná tvorba adventivních kořenů

4. Nežádoucí nadprodukce a oxidace fenolických látek Hnědnutí média Odumírání explantátu

Proč vzniká? Obranná reakce proti možnému vniknutí infekce Fytotoxické substance

Jak se nežádoucí nadprodukci fenolických látek bránit? časté pasážování (tekuté medium) počáteční kultivace v chladu, v klidu příměsi do media (AU – aktivní uhlí, PVP - polyvinylpyrolidon…)

Jak se bránit nežádoucí oxidaci fenolických látek? Preparace pod hladinou vody nebo antioxidační směsi AOX (10% k.citronová a 15% k. ascorbová) inkubace explantátů (5-30 min v AOX směsi) počáteční kultivace v chladu, v klidu příměsi do media (AA – kyselina ascorbová)

Pupenové kultury dřevin

Hormonální regulace mikropropagace z pupenů CK CK CK (AUX) AUX AUX (AUX) (AUX) (bez RR) (GA)

Postup - založení pupenové kultury dřevin 1/ důkladné promytí tekoucí vodou 2/ propláchnutí 70% ETOH 3/ povrchová sterilizace 15 min 20% SAVO na třepačce 4/ propláchnutí sterilní dest. vodou (3x) 5/ odstranění krycích šupin (* antioxydační směs kys. ascorbové 10% a citronové 15%) 6/ odříznutí pupenu s 2 mm lodyhy (*) 7/ přenesení do zkumavky - popis