Výběr dárce k transplantaci hematopoetických kmenových/progenitorových buněk Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, Ph.D. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky 3.LF UK

Kritéria výběru dárce HLA kompatibilita Je-li možnost výběru mezi více dárci, přihlíží se: k věku mladší vhodnější, obvykle ne dárce > 60 let ČNRDD: Věk dárce při zařazení do registru musí být mezi 18 – 35 lety. k pohlaví žena muži TKD – riziko GvHD zvláště, je-li žena aloimunizována proti H-Y a jiným antigenům minoritního histokomp. systému muž ženě s SAA TKD – větší riziko rejekce Hlavním kriterium výběru dárce je HLA kompatibilita. Cílem je snaha vybrat dárce pokud možno co nejvíce HLA-shodného, ale nemusí tomu tak být vždy. Např. pro nemocného s leukemií může být jednovaječné dvojče méně vhodným dárcem než jiný shodný sourozenec, protože riziko relapsu je u syngenní TKD vyšší. Je-li možnost výběru mezi více dárce, přihlíží se také k: H-Y is a histocompatibility antigen of the cell membrane, determined by a locus on the Y chromosome; it is a mediator of testicular organization (hence, sexual differentiation) in the male.

Kritéria výběru dárce Je-li možnost výběru mezi více dárci, přihlíží se: k AB0- a Rh- skupinám nejde o významný rizikový faktor, ale třeba znát při inkompatibilitě odstranit erytrocyty a plazmu k imunitě proti CMV nebezpečí přenosu infekce, pokud dárce poz. a příjemce neg. CMV pozitivita → nepříznivé ovlivnění vzniku a průběhu GvHD i pokud nevznikne klinický obraz infekce

Kontraindikace k dárcovství infekční nemoci přenosné krví vyšetření na protilátky: syfilis, hepatitida B, C, HIV-1/HIV-2, CMV (IgM, IgG) kvůli celkové anestezii hlavně: cerebrovaskulární onemocnění čerstvý infarkt myokardu respirační nedostatečnost malignita těhotenství

HLA systém histokompatibility Geny odpovědné za tkáňovou histokompatibilitu jsou umístěny na krátkém raménku 6. chromozomu. Zde se nacházejí geny pro I. a II.třídu antigenů HLA. V důsledku obrovského polymorfismu HLA antigenů (mnoho variant genů, tj. alel) individuálně charakterizují každého člověka, což se týká i systému transplantačních antigenů. Tato různorodost si vynucuje pečlivou typizaci při výběru vhodných dvojic dárce-příjemce před Tx. Pro Tx jsou důležité antigeny HLA I třídy A, B, C a HLA II třídy DR, DP, DQ. Zvláště významné jsou A, B a DR. obrovský polymorfismus genů Tx důležité antigeny HLA I. třídy A, B, C HLA II. třídy DR, DP, DQ

HLA I. třídy exprese na povrchu jaderných buněk, trombocytů prezentace antigenů CD8+ T lymfocytům asi 20 genů, nejdůležitější HLA A, B, C HLA II. třídy exprese na antigen prezentujících buňkách (DC, B lymfo, makrofágy) prezentace antigenů CD4+ T lymfocytům 3 páry genů kódující a a b řetězce: HLA DR, DP, DQ HLA DR: a řetězec monomorfní, navíc gen pro b řetězec Molekula HLA I. třídy složena z 1 variabilního těžkého alfa řetězce tvořeného 3 doménami a nekovalentně vázaného nepolymorfního beta2-mikroglobulinu (kódovaný mimo MHC). Domény alfa 1 a 2 tvoří vazebné místo pro peptidy dlouhé 8-10 AK. Do této třídy je zahrnuto asi 20 genů, z nichž nejdůležitější jsou geny HLA A, B, C. Molekula HLA II. třídy je heterodimerní, složena z řetězců alfa a beta, které jsou kódovány dvěma geny. Tvoří vazebné místo pro peptidy dlouhé 10-30 AK pocházející z extracelulárních antigenů. Jsou rozpoznávány CD4+ lymfocyty.

Polymorfismus HLA lokus Antigenní varianty DNA varianty HLA-A 25 83 HLA-B 53 186 HLA-C 11 42 HLA-DR (pouze b řetězec) 20 221 HLA-DQ (a a b řetězce) 9 49 HLA-DP (a a b řetězce) 6 88 Klinická genetika, 2001 antigenní varianty (specifity) – některé důsledkem odlišností v AMK složení v určitém a nebo b řetězci, určené serotypizační metodou DNA varianty – u HLA alel definovaných serologicky zjištěny další varianty v DNA sekvenci Př. alela HLA B27 serologicky jedinečná, nalezeno 12 různých variant nukleotidových sekvencí V jednotlivých lokusech HLA-A,B,C,DP,DQ,DR bylo rozpoznáno množství odlišných antigenních variant. Tato tab ukazuje složitost a velký polymorfismus systému. Podle tradičního systému HLA nomenklatury byly různé alely navzájem odlišeny serotypizačně na základě odlišností ve struktuře alfa nebo beta řetězců (kde se rozpoznává Ag). Tak jak byly postupně identifikovány a sekvenovány další geny odpovědné za kódování antigenů I. a II.třídy, počet alel se enormně rozšířil. To znamená, že u alel původně serologicky definovaných bylo možno zjistit, že jsou složeny ze dvou nebo více alel, protože byly zjištěny varianty v DNA sekvenci.

Nomenklatura HLA systému HLA A*0101 lokus serologická specifita specifická alela určená sekvenací nukleotidů Př. HLA A*0101, HLA A*0102 – stejná serologická specifita A1 odlišující se v nukleotidových sekvencích HLA DRB1*0401 třída rodina řetězec a/b číslice označující konkrétní gen serologická specifita specifická alela označení w = pracovní (working) označení Písmeno A určuje lokus. První 2 číslice po hvězdičce informují o odpovídající serologické specifitě, která je zde A1. Poslední 2 číslice označují specifickou alelu určenou nuleotidovou sekvenací. K označení molekul HLA II. třídy se používají 3 písmena. První označuje třídu, druhé rodinu a třetí alfa nebo beta řetězec molekuly HLA II. Následují číslice označující kokrétní gen, za hvězdičkou, stejné jako u HLA I. Jeli do označení zahrnuto písmeno w, znamená to, že se jedná o dočasné pracovní označení.

Polymorfismus a dědičnost HLA haplotypů obrovský počet polymorfismů (ne všechny!) příčinou variability ve struktuře povrchových HLA proteinů HLA alely přenášeny společně jako haplotypy každý rodič má 2 exprimované haplotypy dítěti předá jeden nebo druhý → existuje 25% šance, že dva sourozenci zdědí stejný haplotyp od jednoho z rodičů AB + CD → AC / AD / BC / BD značná variabilita v profilu a frekvenci HLA variant např. HLA A2 nejčastější ve všech populacích HLA A24 u kavkazských, ale ne u afro-Američanů a Asiatů etnicky odlišná distribuce jednotlivých HLA alel i haplotypů HLA alely jsou na daném chromozómu tak těsně vázány (sousedící geny), že jsou přenášeny společně jako haplotypy, tj. bloky genů mezi kterými pouze vyjímečně dochází ke crossing-overu (rekombinaci). Tyto alely jsou kodominantní, každý rodič má 2 exprimované haplotypy a předává jeden nebo druhý každému svému dítěti. Výsledkem je, že rodič a potomek sdílejí pouze jeden haplotyp a existuje tedy 25% šance, že dva sourozenci zdědí stejný haplotyp od jednoho z rodičů. Haplotyp = sada HLA genů na 1 chromozómu

Inkompatibilita při Tx může vést k selhání štěpu role neshody v HLA-A, -B, -C, -DR, celkový počet neshod ovlivňuje riziko selhání vznik GvHD zvýšení rizika vzniku aGvHD při neshodách v I. a/nebo II. třídě HLA snížení přežití neshody v HLA-A, -B, -C, -DR ale ne -DQ, -DP snižují přežití dle U.S. studie jednotlivé studie se ale ve výsledcích různí

HLA typizace Serotypizace stanovení HLA I. i II. třídy odlišení molekul proteinů na základě rozdílů v antigenních charakteristikách pomocí panelu typizačních antisér, zdrojem krev matek po 2 a více porodech (1 otec) – sérum obsahuje dostatek protilátek proti HLA molekulám plodu zděděných po otci velmi pracný postup časově méně náročný než genotypizace určitá míra nepřesnosti Přesnost v HLA testování je velmi důležitá pro výsledek Tx. To platí zejména v případě nepříbuzných dárců. Klasický přístup identifikuje konkrétní HLA molekuly, tj. proteiny, kde k odlišení slouží antigenní rozdíly, které jsou podmíněny unikátním složením AK v polymrofní části molekuly HLA. Používají se typizační séra, jejichž základním zdrojem je krev matek.. Pokud je k dispozici dostatečně velký panel sér, je možné určit expresi konkrétních HLA molekul I.třídy na T buňkách testovaného člověka pomocí mikrocytotoxického testu. Barvivo=ethidium bromid K průkazu HLA molekul II.třídy je nutné mít B lymfo testovaného člověka, testují se HLA DR, DQ

HLA typizace Rutinní typizace HLA I.třídy: Serotypizace Rutinní typizace HLA I.třídy: 120 typizačních sér v mikrotitrační destičce přidány testované T lymfocyty, po inkubaci přidán komplement pozitivita = vazba protilátky séra na T lymfocyty, komplement je zlyzuje hodnocení pomocí fluorescenční mikroskopie (vazba barviva na DNA v lyzované buňce) Rutinní typizace HLA II.třídy: panel 60 typizačních sér přidány testované B lymfocyty, mikrocytotoxický test testování HLA DR, DQ

HLA typizace Klinický přístup obvykle: Genotypizace (DNA typizace) pomocí PCR a specifických primerů pro konkrétní alelu, izolace DNA z krve 2 přístupy: nízké rozlišení – identifikace skupiny alel sdílející stejné polymorfní sekvence („2-digits) vysoké rozlišení – identifikace individuálních alel („4-digits) větší časová náročnost jednoduchá technika, snadná automatizace citlivější metoda Př. serotypizací se určí A*02, dalších 64 známých alel (A*0201-0264) genotypizace definuje alelu A*0201 Klinický přístup obvykle: HLA I.třídy serotypizačně, HLA II.třídy genotypizačně Genotypizace již známých alel, kde známe sekvenci. Kde se objeví nové alely, je nutno nejdříve určit sekvenací genovou sekvenci, aby bylo možno urcit specificke primery a detekovat tak novou alelu! Např. v Africe. Mnoho Evropanů nebo Japonců bylo uz otestovano, testovani pribuznych. Příklad: serotypizací se určí, že se jedná o serotyp A*02, má dalších známých 64 alel, které se dál dourčí genotypizací.

HLA typizace - příklad Serotypizace určí serotyp jedince: A1,A3,B7,B8,DR3,DR15(2),DQ2,DQ6(1) Genotypizace dourčí HLA fenotyp jedince: A*0101, *0301, Cw*0701,*0702, B*0702,*0801, DRB1*0301,*1501, DQA1*0501,*0102, DQB1*0201,*0602 složen ze 2 haplotypů od rodičů: A*0101 : Cw*0701 : B*0801 : DRB1*0301 : DQA1*0501 : DQB1*0201 (serotypizačně A1-Cw7-B8-DR3-DQ2) A*0301 : Cw*0702 : B*0702 : DRB1*1501 : DQA1*0102 : DQB1*0602 (serotypizačně A3-Cw7-B7-DR15-DQ6)

HLA typizace pokrevních příbuzných Typizace pacienta a příbuzného dárce většinou dostatečná typizace HLA-A, -B, -DR dvou číslic za * pro určení haplotypu od matky a otce potvrzení genetické identity ve všech HLA genech (A,B,C,DR,DP,DQ) na obou chromozómech = shoda 12/12 HLA-DP se obvykle netestuje – shoda 10/10 Pokud dojde k potvrzení genetické identity ve všech testovaných HLA genech na obou chromozómech, jedná se o shodu 12 z 12. Běžne v klinické praxi se však HLA-DP netestuje, takže shodný dárce se bude shodovat v 10 genech z 10.

HLA typizace pokrevních příbuzných ÚHKT, Národní referenční laboratoř pro DNA diagnostiku Oddělení HLA analýzy genotypizace vždy při indikaci HSCT, současně odběr přímých pokrevních příbuzných (sourozenci, rodiče, příp. dětí pacienta) standartně HLA-A, -B, -DRB1 na úrovni určení alelických skupin (nízké rozlišení) a stanovení obou haplotypů = serologie HLA I.třídy a genotypizace HLA II.třídy na úrovni „2-digits“ při nejasnostech v určení haplotypů genotypizace na úrovni určení jednotlivých alel (vysoké rozlišení, „4-digits“)

Po určení shody/neshody s příbuznými nalezen HLA shodný příbuzný dárce v úzké rodině (tj. sourozenec, rodič) odběry pro konfirmační vyšetření, genotypizace na úrovni určení alelických skupin (nízké rozlišení) v lokusech HLA-A,-B,-C,-DRB1,-DQB1 (před zahájením přípravného režimu před Tx) nenalezen vhodný dárce v úzké rodině hledání v širší rodině - strýc, sestřenice apod. (HLA-A,-B,-DRB1 nízké rozlišení) nebo indikace k nepříbuzenské HSCT (hledání v registrech) po nalezení dárce: konfirmační vyšetření genotypizací lokusů HLA-A,-B,-Cw,-DRB1,-DQB1 na úrovni určení jednotlivých alel (vysoké rozlišení) Pokud je nalezen HLA shodný dárce v úzké rodině, tj. sourozenec nebo rodič, provedou se další odběry pro potvrzení typizace. Provádí se genotypizace na úrovni určení alelických skupin nízkým rozlišením v lokusech… a to před zahájením přípravného režimu před Tx. Pokud v úzké rodině vhodný dárce nalezen není, indikuje se hledání v širší rodině, tím se myslí třeba stýc, teta, sestřenice apod., u kterých se genotypizačně určí lokusy HLA-A,-B,-DRB1 s nízkým rozlišením. Druhá možnost je pak indikace k nepříbuzenské Tx a zahájí se hledání v národním nebo zahraničních registrech dobrovolných dárců. Po nalezení dárce se opět provede konfirmační vyšetření.

HLA typizace nepříbuzných dárců musí se vyšetřit geny HLA- A*,B,Cw* , DRB1* a DQB1* stupeň shody vyjadřován jako např. 10/10, 9/10, 8/10 nepovinné vyšetření genů DPB1*, DRB3*-5* nebo DQA1* při větším počtu srovnatelně shodných dárců, kteří se shodují v: AB0, věk, pohlaví, CMV status shoda hodnocena dle výsledku "4-digits" typizace Pár - DRB1*1101 vs. DRB1*1103 je neshodný preference HLA neshod při možnosti výběru z více dárců: Cw*>A*B*,DQB1*>DRB1 Cw* nejvíce akceptovatelná neshoda, DRB1 nejméně akceptovatelná neshoda non-HLA neshody (krevní skupina, CMV) mohou mít větší vliv na výběr dárce než hierarchie HLA neshod, viz. příklad: V případě HLA typizace nepříbuzných dárců se musí se vyšetřit geny:.., tj. 5 základních lokusů Neshody v polymorfismu intronů či v tichých mutacích ("silent mutations"), tedy 5.-8. "číslo" nejsou za neshody považovány. Pár s touto úrovní neshod je tedy považován za kompatibilní v dané alele (genu). Příklad: Pár - B*070201 vs. B*070203 je považován za shodný v tomto genu. Hierarchií nebo preferencemi u HLA neshod u nepříbuzného páru rozumíme hierarchii důležitosti shody u hodnocených HLA genů. Tedy vlastně jaké neshody jsou více a které méně akceptovatelné v případě možnosti výběru z více 9/10 či 8/10 shodných párů nepříbuzných párů. Přes trvající kontroverze jsou neshody v I. třídě HLA a DQB1* genu preferovány před neshodami v DRB1* genu. Celková preference (hierarchie) neshod je následující: Cw*>A*B*,DQB1*>DRB1 (geny vyjádřeny v pořadí od nejvíce do nejméně akceptovatelné neshody).

HLA typizace nepříbuzných dárců Příklad pacient: A*0201, B*3501,1501, Cw* 0401,0303… CMVneg, KS Aneg dárce #1: A*0201, B*3503, 1501, Cw*0401, 0303, CMVneg , KS Aneg dárce #2: A*0201, B*3501, 1501, Cw*0401, 0304, CMVpoz, KS Bpoz -> přes neshodu v HLA-B genu je preferován dárce č. 1 (CMV +ABO kompatibilita).

Vyhledávání v registrech dobrovolných dárců v ČR 3 registry Český registr dárců krvetvorných buněk (IKEM, Praha) Banka pupečníkové krve (ÚHKT, Praha) Český národní registr dobrovolných dárců (ČNRDD, Plzeň) založen 1992 v Plzni Nadací pro transplantace kostní dřeně, vytvořena síť 7 dárcovských center v ČR 1993 spolupráce prostřednictvím Bone Marrow Donor Worldwide se sídlem v holandském Leidenu 1997 smlouva o spolupráci s americkým Národním programem dárců dřeně do roku 1998 financován výhradně Nadací pro transplantace kostní dřeně 2000 uzavíraní smluv se zdravotními pojišťovnami – hrazení některých nákladů při vyhledávání dárců z registru a podrobnějším HLA vyšetřováním CNRDD byl založen v roce 92 Nadací pro transplantaci kostní dřeně a postupně byla vytvořena síť 7 dárcovských center v celé ČR, které byly ochotny spolupracovat. V roce 93 byla navázána mezinárodní spolupráce prostřednictvím BMDW se sídlem v holandském Leidenu. V roce 1997 pak podepsal smlouvu o spolupráci s americkým Národním programem dárců dřeně. V průběhu roku 2000 došlo k uzavírání vzájemných smluv se zdravotními pojišťovnami, které začaly poprvé hradit některé náklady spojené s aktivním vyhledáváním nevhodnějších dárců z registru pro konkrétní pacienty a náklady spojené s jejich podrobnějším HLA vyšetřováním. V ČR máme registry dva (Centrální registr dárců dřeně, Plzeň, a Národní registr dárců KD, Praha, celkem registrují více než dvacet tisíc dárců).

Celosvětový registr dárců Bone Marrow Donor Worldwide 13,015,375 (last updated: 24-Mar-2009) 60 registrů KD ze 44 států + 42 registrů pupečníkové krve z 26 států Německo cca 3 mil dárců, ČR cca 60 tis USA – 14 registrů, kolem 5,5 mil dárců

http://www.kostnidren.cz/registr/ http://www.czechbmd.cz/ Dárcovská centra v ČR http://www.kostnidren.cz/registr/ http://www.czechbmd.cz/ Brno České Budějovice Hradec Králové Most Olomouc Ostrava Plzeň Praha Ústí nad Labem spolupráce s dalšími náborovými centry v regionech

Hlavní indikací k hledání dárce pro české i zahraniční nemocné jsou v posledních letech akutní leukémie, ve výčtu diagnóz vhodných k transplantaci jsou ale mnohé další nemoci nádorového i nenádorového charakteru, včetně útlumů krvetvorby, vrozených i získaných poruch imunity a látkové přeměny. Během posledních let poklesl počet transplantačních indikací pro chronickou myeloidní leukémií (v souvislosti se zavedením nových léků, účinných při této nemoci).

Suverénně největším zahraničním poskytovatelem vhodných dárců k transplantacím v ČR se v průběhu let stal registr ve Spolkové republice Německo, který v současnosti disponuje již třímilionovou databází dobrovolných dárců. Následují registry v Anglii (přes 700 000 dárců) a v USA (5 milionů dárců).

AA - Praha BM - Brno CB - České Budějovice HK - Hradec Králové MO - Most OL - Olomouc OS - Ostrava PL - Plzeň UL - Ústí nad Labem V souhlase s dlouhodobou strategií ČNRDD byl i v roce 2006 věnován prvořadý význam kvalitě vyšetření transplantačních znaků registrovaných dárců. V daném roce bylo provedeno u 1 917 dárců molekulárně genetické vyšetření HLA II. třídy - DRB1* antigenů, a to prakticky u všech nově registrovaných dobrovolníků a u další části dárců, registrovaných v dřívějších letech. Celkový počet dárců, vyšetřených těmito přesnými metodami tak stoupl k 31. 12. 2007 na 26 020, tj. více než 81% dárcovské databáze. Zároveň se podařilo v databázi vyšetřit již u 3 535 dárců kompletní transplantační HLA znaky A*, B* a DR* DNA metodou s vysokým rozlišením, což má mimořádný význam pro rychlost určení dárce pro konkrétního nemocného a zvyšuje využitelnost takto přesně specifikovaných dárců v průběhu národního i mezinárodního vyhledávacího procesu. Podíl jednotlivých dárcovských center na celkové databázi ČNRDD odpovídá velikosti příslušného spádového regionu a době zapojení příslušného centra do projektu registru - Brno (BM) 1995, ÚVN Praha-Střešovice (AA) podzim 2002. Největší počet nových dobrovolníků v roce 2007 se registroval v dárcovském centrum v Hradci Králové - 240.

Anthony Nolan Trust první registr dárců kostní dřeně na světě založen 1974 ve Velké Británii (Westminster Children‘s Hospital) založen matkou Anthony Nolana (WAS, 1971 – 1979) v současnosti jeden z největších registrů na světě http://www.anthonynolan.org.uk/ Vědělo se, že jedinou možnou léčbou je transplantace kostní dřeně od kompatibilního dárce. Jenže tehdy ještě žádné registry neexistovaly, neporváděly se HLA typizace, takze hledat darce bylo jako hledat jehlu v kupce sena. Shirley zacla pracovat na systemu, který by analyzoval tkanovy typ jedince a zaznamenal se v prijatelne forme se vsemy dalsimi informacemi o darci. Anthony zemrel, aniz by byl darce nalezen.