Biochemické metody separace proteinů

Charakterizace proteinu Molekulová hmotnost celého proteinu Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců Určení primární struktury Aminokyselinové složení Aminokyselinové sekvence Trojrozměrná struktura Izoelektrický bod proteinu Spektroskopické vlastnosti

Separační metody Separace založené na velikosti molekul (dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) C. Separace založené na základě elektrického náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie)

A. Separace založené na velikosti molekul Dialýza a ultrafiltrace Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem Propustnost membrány pro rozpuštěné látky Velikost povrchu membrány Pohyb částic < 1000 Da

Centrifugace v hustotním gradientu Lineární hustotní gradient (sacharóza, CsCl) centrifugace při vysokých otáčkách (150 tis. g) sedimentace proteinů určitou rychlostí podle velikosti, hustoty, tvaru molekul (je dosažena rovnováha mezi hustotou roztoku a částicí) po centrifugaci jsou proteiny v gradientu rozděleny a zahuštěny

Chromatografie

Gelová filtrační chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie) Hydrofilní gelové částice (polymer) Uvnitř každé částice jsou póry Látky se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti)

Určení molekulové hmotnosti z kalibrační křivky Kalibrační křivka Jednotlivé frakce proteinů se detekují spektrofotometrem. Rychlost průtoku proteinu je úměrná velikosti molekuly.

Optimální vlastnosti gelu pro gelovou filtraci: inertní matrice vůči děleným složkám i elučním roztokům chemická stabilita během několika kroků, při různém pH a při různé teplotě mechanická stabilita při vyšším tlaku (nesmí se deformovat) optimální velikost gelových částic (příliš malé částice - rozdělení je přesnější, ale pomalejší a naopak)

B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů Izoelektrická precipitace rozpustnost globulárních proteinů ovliňuje pH při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat – mají 0 náboj protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v proteinu) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI. náboj proteinu pI pH roztoku je nižší pH roztoku je vyšší + -

Rozpustnost proteinu prudce stoupá: pH roztoku < pI proteinu pH roztoku > pI proteinu

Vysolování proteinů neutrálními solemi Princip Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný) Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok Molekuly proteinu koagulují díky hydrofóbním interakcím

Vyšší koncentrace neutrální soli (NaCl, KCl) ovlivňuje rozpustnost globulárních proteinů. Povaha aniontu (Cl-) se ve vysolovacím efektu uplatňuje více než povaha kationtu Na+). Dvojmocné a vícemocné anionty jsou účinnější než jednomocné anionty - MgCl2 a (NH4)2SO4 více než NaCl. Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %).

Frakcionace (rozdělení) proteinů organickými rozpouštědly etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda) (dielektrická konstanta - polarita rozpouštědla) sníží se stupeň ionizace a zvýší přitažlivé síly mezi opačnými náboji, tím se sníží rozpustnost. udržováním roztoku při teplotách kolem 0o C se snižuje nebezpečí denaturace proteinu.

C. Separace na základě elektrického náboje Metody vycházejí z acidobazického chování proteinů (typ a počet ionizovatelných skupin aminokyselin) Elektroforetické metody Dělení látek s odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při elektroforéze dělí nabité molekuly (ionty): při pH > pI - protein je aniontem, má celkový (-) náboj – pohyb k anodě při pH < pI - protein je kationtem, má celkový (+) náboj – pohyb ke katodě

Zónová elektroforéza (dělení plasmatických bílkovin) Proužek acetátcelulózy – nanesení vzorku. Elektroforéza ( rozdělení podle různých elektroforetických pohyblivostí). Rozdělené proteiny na zóny. Densitogram (densita je přímo úměrná koncentraci)

Iontově výměnná chromatografie Proteiny se pohybují kolonou rychlostí, která je dána jejich celkovým náboj v roztoku o daném pH. pH a obsah solí mobilní fáze, která obklopuje molekuly proteinů ovlivní jejich ionizaci. Syntetický polymer (např. pryskyřice) obsahuje nabité funkční skupiny: záporně nabité kuličky – katexy (vazba kationtů) kladně nabité kuličky – anexy (vazba aniontů) Katex zadržuje kladně nabité částice, záporně nabité se pohybují s rozpouštědlem (mobilní fází). Navázané proteiny se z vazby uvolní změnou iontové síly nebo změnou pH roztoku protékajícího chromatografickou kolonou

D. Separace pomocí specifického ligandu Afinitní chromatografie Využití biologických vlastností proteinů - specifická nekovalentní vazba s jinou molekulou (ligand)

použití nosiče - agarózové partikule (Sephadex) enzym + koenzym hormon + receptor antigen + protilátka inhibitor+substrát lektin+cukr použití nosiče - agarózové partikule (Sephadex)

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza Gel polyakrylamidu nebo agarózy. Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza SDS, sodium dodecyl sulfate, dodecyl síran sodný – iontová povrchově aktivní látka