Biochemie I Aminokyseliny a peptidy

Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)

AMINOKYSELINY Když se řekne AK ( -COOH, -NH2 nebo -NH-) prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny: - (=2-), -(=3-)..... -(= poslední) -alanin: +H3N-CH2-CH2-COO- -aminobutyrát (GABA): +H3N-CH2-CH2-CH2-COO-

-aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera) COO- COO-   D: H CNH3+ L: NH3+ CH   R R Kódované aminokyseliny (20):  -aminokyseliny (kromě prolinu – NH2 skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který nese karboxylovou skupinu.

AMINOKYSELINY L--aminokyseliny: kódované (= proteinogenní, viz dále) nekódované: - odvozené od kódovaných aminokyselin -Tyrkatecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...) -vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace) - metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin)

Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Glycin Gly   N Alanin Ala Valin Val E Leucin Leu

Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Isoleucin Ile   N E Prolin Pro Fenylalanin Phe Tyrosin Tyr P Tryptofan Trp

Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Histidin His   Z N Serin Ser P Threonin Thr E Cystein Cys Methionin Met

Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Lysin Lys   Z E Arginin Arg N Asparagová kyselina Asp K Glutamová kyselina Glu Asparagin Asn P Glutamin Gln

Naučit se AK včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci

Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců Funkční skupiny: Alifatické Aromatické Hydroxylové Sulfhydrylové Kyselé Basické Polární Nepolární

Hydrofobní aminokyseliny

Polární aminokyseliny

Kyselé aminokyseliny

Bazické aminokyseliny

Větvené aminokyseliny leucin, valin, izoleucin energetické substráty nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata) součástí specializovaných roztoků aminokyselin

Kódované aminokyseliny: Jednopísmenkové zkratky   Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v pH 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v pH 7 = 0)

Úvod do teorie elektrolytické disociace: kyselina: HA  H+ + A- např. CH3-COOH  H+ + CH3-COO- termodynamická disociační konstanta zdánlivá přičemž

Úvod do teorie elektrolytické disociace: báze: B + H2O  BH+ + OH- např: CH3-NH2 + H2O  CH3-NH3+ + OH- bazická zdánlivá disociační konstanta: ale: Kw = [H+] . [OH-] a tedy:   po spojení: [H2O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/KB: Kyselá disociační konstanta KA ionisované formy báze B (např. CH3-NH3+) je tedy rovna:

KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pKA SKUPIN VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH   -COOH ,-COOH imidazolium -SH -NH3+ fenol -NH3+ guanidinium 2,5 4,0 6,0 8,3 9,5 10,1 10,5 12,5

Hodnoty pKA disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 oC) -karboxylová C-koncová 1,7 - 2,6 1,8 - 3,6 imidazolová His 6,0 5,6 - 7,0 -aminová Lys 10,53 9,4 - 11,0 sulfhydrylová Cys 8,33 8,3 - 8,6 Funkční skupina Aminokyselina Hodnoty pKA nalezené ve volných aminokyselinách Hodnoty pKA nalezené v bílkovinách ,-karboxylová Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0 - 4,7 -aminová N-koncová 8,8 - 10,7 7,9 - 10,6 fenolová Tyr 10,07 9,8 - 10,8 guanidylová Arg 12,48 11,6 - 12,6

TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN   Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit pH, když budu přidávat NaOH? Na začátku: jen HA, množství A- odpovídá množství přidaného louhu. převedeme na pH: (Hendersonova - Hasselbalchova rovnice)

TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN

Titrační křivka glycinu

Cystin = cystinylcystein

Titrační křivka cystindihydrochloridu

ISOELEKTRICKÝ BOD   DEFINICE: pH, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pI Isoionický bod: pH, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.

ISOELEKTRICKÝ BOD př.: Gly (titruji Gly.HCl) KA1 KA2   Z = +1 (Gly1+) 0 (Gly) -1 (Gly-1) Ale v pH = pI platí: [Gly1+] = [Gly-1] takže:

Isoelektrické body kódovaných aminokyselin Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pI (nutno načrtnout titrační křivku)   Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pKA v okolí pI) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AK pI Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6 Ala Thr 5,6 Tyr Lys 9,6 Val Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8 Leu Met Asn 5,4 Asp 3,0 Ile Pro 6,4 Gln Glu 3,2

OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1 mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm.   Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace)

Chemické reakce AK Stanovení AK (reakce aminoskupin): ninhydrin, Sangerovo činidlo, dansylchlorid

Chemické reakce AK Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita např.   značení bílkovin radioaktivním jodem blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků)

Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby Chemické reakce AK Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby

Chemické reakce AK

Chemické reakce AK

Nomenklatura peptidů N- konec (začátek), C-konec (konec) acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin   Pozor: Ala.Tyr  Tyr.Ala

PŘIROZENÉ PEPTIDY Zvláštnosti struktury: ·     nekódované aminokyseliny (ornithin, -alanin ...) ·     často i D-aminokyseliny ·     někdy i tzv. -peptidové vazby (Glu) ·     cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby) ·     větvené struktury blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)

Biosynthesa meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí (ne na ribosomech cestou protheosynthesy)

Skupiny přirozených peptidů ·     di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...) ·     peptidové hormony (oxytocin, vasopresin....přechod k proteohormonům) ·     neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny (15 - 32 AK) ·     peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK) ·     peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: Amanita phalloides) ·     protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb) polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly--L-Glu, poly--D-Glu)

Skupiny přirozených peptidů

URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ AK1-AK2-AK3 ....AKn  kyselá nebo bazická hydrolysa  AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn (určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny - chromatografické dělení)

URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN V ŘETĚZCI Edmanovo odbourávání

N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY Sangerova reakce

N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY Edmanovo odbourávání

SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy, karbodiimidová synthesa) b) blokování skupin, které nemají reagovat c) synthesa peptidové vazby d) odblokování

Chromatografické metody pro separaci proteinů Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie

Ionexová chromatografie Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! Celulosové a dextranové ionexy

Ionexy Katexy – záporný náboj  vazba kationtů silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO- Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

Ionexová chromatografie proteinů Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

Ionexová chromatografie Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

Typická ionexová chromatografie Loading ends, Low salt wash begins Salt gradient Protein absorbance II III Salt gradient ends Salt gradient begins Peak of unbound protein Loading starts I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

Příklad 1 Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin (pI = 5,97), threonin (pI = 6,53) a lysin (pI = 9,74) v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex). V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?

Příklad 2 Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen (isoelektrické body pI jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru pH 7,0. V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?