PSA a jeho izoformy pro časnou diagnostiku karcinomu prostaty. Kristian Šafarčík Centrum laboratorní diagnostiky FN Ostrava

Počet nových nádorových onemocnění (USA 1999) Prsa 184,300 Plíce 78,100 Střevo 65,900 Prostata 210,000 Plíce 98,900 Střevo 67,600 Not only is it the Number 1 cancer in men, but it is also the Number 2 killer of men

Onemocnění prostaty je významný zdravotnický problém Karcinon prostaty(KP) Významné a časté maligní onemocnění u mužů 2. nejvýznamnější příčina mortality V USA vroce 1999: 210,000 nových případů; 37,000 úmrtí Incidence <10 % ve věku 40-50 let; 33% u mužů >50 let Benigní HyperlazieProstaty (BPH) Přítomna u 4 % 40 letých, 30 % ut 50 letých, 75 % u 80 letých Jiné Akutní a chronická prostatitida, infarkt prostaty, jiné neoplasmy

Stanovení PSA PSA Objeveno v roce 1979 (Wang a kol. - gelová elektroforéza) První komerční metoda v roce 1986 V ČR dostupný skoro 20 let Nárůst počtu stanovení PSA v posledních 10 letech Klíčový záměr Snížení mortality na karcinom prostaty, je nutné se zaměřit na časnou detekci nádorového onemocnění prostaty u mladších mužů Prostatický specifický antigén (PSA) byl poprvé objeven v roce 1979 a první komerční souprava byla dostupná v roce 1986. V posledních 10 letech je dramatický nárůst použití PSA zejména díky zavedení automatických metod stanovení. V současné době je zaměřené testování především na mladší muže z cílem snížit úmrtnost na rakovinu prostaty.

Molekulární biologie PSA Jednořetězový glykoprotein s 237 AK Molekulová hmotnost 33,000 Da Karbohydratová složka je připojena na kys. asparagovou v pozici 45 Gen je lokalizován na dlouhém ramínku chromozomu 19, má 6 kB a sestává se ze 4 intronů a 5 exonů Molekula má 5 disulfidických vazeb Aktivní místo enzymu je složeno ze 3 AK, histidinu 41, aspartatu 96 a serinu 189 Izoelektrický bod se pohybuje od 6.5 do 7.5 (hlavní forma při pI 6.9 s řadou izomerů) Proteolytický enzym – serinová proteináza PSA je jednořetězový protein, který obsahuje 237 aminokyselin. PSA je serinová proteáza s molekulovou hmotností 33,000 Daltonů. Karbohydrátová část je připojena na aspartát v pozici 45. Gen pro PSA je lokalizován na dlouhém ramínku chromozómu 19, má velikost 6 kilobází, a má 4 introny a 5 exonů. PSA molekula má 5 disulfidických vazeb z obsažených 10 cysteinů. Aktivní místo PSA se skládá ze 3 aminokyselin: histidine 41, aspartate 96, and serine 189. Izoelektrický bod se pohybuje od 6.5 to 7.5 s majoritní formou při pI 6.9 z četných izomerů.

Molekulární biologie PSA PSA patří do skupiny humánních kalikreinů Je to hK3 Lidské kalikreiny jsou kodovány geny na 19. chromozomu hK1 a hK2 (62% resp. 80% homologie s primární strukturou PSA) PSA a hK2 jsou androgenně dependentní a omezené na prostatickou tkáň V systémové cirkulaci existuje PSA volný a vázaný Vázaný na alfa–1–chymotrypsinem (50-90% stanovitelného PSA imunochemickými metodami) a alfa-2-makroglobulinem (imunochemicky nedetekovatelný) PSA je jednořetězový protein, který obsahuje 237 aminokyselin. PSA je serinová proteáza s molekulovou hmotností 33,000 Daltonů. Karbohydrátová část je připojena na aspartát v pozici 45. Gen pro PSA je lokalizován na dlouhém ramínku chromozómu 19, má velikost 6 kilobází, a má 4 introny a 5 exonů. PSA molekula má 5 disulfidických vazeb z obsažených 10 cysteinů. Aktivní místo PSA se skládá ze 3 aminokyselin: histidine 41, aspartate 96, and serine 189. Izoelektrický bod se pohybuje od 6.5 to 7.5 s majoritní formou při pI 6.9 z četných izomerů.

Fyziologická funkce PSA PSA je proteolytický enzym Zkapalňuje spermatickou tekutinu PSA je secernován epeiteliálními buňkami lemujícími aciny a dukty prostatické tkáně Ve spermatu je koncentrace PSA velmi vysoká (0,2 – 0,5 mg/ml) Do krevního oběhu se dostává přes prostatickou bazální membránu, stroma, kapilární bazální membránu a kapilární endoteliální buňku (normálně koncentrace nízké do 3,5 ug/l)

Prostata Prostate Normální fyziologické podmínky Prostatická luminální Seminální tekutina pPSA Prostatická luminální epiteliová buňka PSA Seminální plasma Prostate Krev Prostata (Prostatická tekutina) PSA podporuje spermatickou motilitu (rozpouští seminální sraženinu )

PSA je tkáňově specifické nikoliv specifické pro onemocnění prostaty Prostata Sérum Objem žlázy ~30 cm3 PSA ~1 mg/cm3 tissue Objem ~3,500 ml PSA ~10,000 ng/ml

PSA rodina Lumen Prostatické epiteliální buňky Bazální buňky Periferní cirkulace

Antigenní epitopy PSA Total PSA Epitop IV Katalytické aktivní centrum Comprehensive Textbook of Genitourinary Oncology (2000), Chapter 38. Total PSA Epitop IV Katalytické aktivní centrum Total PSA + hK2 Epitop I Free PSA Epitop IIIb Total PSA Epitop II Total PSA Epitop IIIa

Hlavní formy PSA v séru Celkové imunoreaktivní PSA volné PSA PSA-ACT PSA-MG Complexován s kDa Imunoreaktivní Nákres Proporce Označeno jako 1 - a Antichymotrypsin 2 a Macroglobulin - 33 100 780 Ano Ano Ne ACT MG PSA PSA PSA 5-50 % 50-95 % ? volné komplexované skryté PSA PSA PSA Celkové imunoreaktivní PSA

Co je volné PSA v séru? Komplexované PSA Enzymaticky inaktivní 15% Enzymaticky inaktivní Nekomplexuje se s ACT Nižší % pří karcinomu Vyšší % při BPH

Formy PSA Dvě hlavní formy PSA ACT PSA Volné PSA PSA v komplexu Vázané na alpha-1-antichymotrypsin (ACT) Antibody binding sites PSA existuje v séru ve dvou hlavních formách: volné PSA a v komplexu s ACT α-1-antichymotrypsinem. Imunoanalýza PSA měří celkové Total PSA – sumu Free PSA and PSA-ACT. Objev různých molekulárních forem PSA má zásadní význam pro diagnostiku časné kurabilní diagnózy karcinomu prostaty (Urology, 1997)

Distribuce PSA v séru Distribuce PSA v séru Zastoupení (%) Vázaný na proteiny 60 - 95 Alfa-1-antichymotrypsin 60 – 90 Alfa-2-makroglobulin 10 -20 Alfa-1-trypsinový inhibitor 1 – 5 Volný – enzymově inaktivní 5 - 40

Prostata Prostate Volné formy PSA asociované s onemocněním prostaty pPSA Prostatická luminální epitelialní buňka PSA Seminální plazma Prostate Krev Nádor pPSA* Prostata BPH BPSA Mikolajczyk et al, Urology 2002; 59: 797-802.

BPS-A pPSA BPH Volné formy PSA asociované s onemocněním prostaty Tranzitní zóna pPSA Nádor Prostatická periferní zóna Centrální zóna (degradované PSA) (prekurzor PSA)

Co je BPH-A ? Immuno-barvení prostatické tkáně na BPH-A Benigní tranzitní zóna BPH-A or BPSA is a BPH-associated form of PSA characterized by simultaneous internal peptide cleavages at 2 sites: Lysine145 and Lysine182. BPH-A is significantly elevated in biopsy negative men with elevated PSA compared to controls nádorová periferní zóna Mikolajczyk et al, Urology, 2002; 59: 797-802.

Co je BPS-A? BPS-A je s BPH (benigní hyperplasii prostaty)-asociovaná forma PSA charakterizovaná simultanním štěpením peptidické vazby ve 2 místech: Lys145 and Lys182 Lys182 NH clip 2 Lys145 clip COOH

Formy PSA detekované pomocí HPLC v tranzitní zoně BPSA PSA Tranzitní zóna Fluorescence (232 nm ex / 334 nm em) Periférní zóna u nádoru Periférní zóna normální 2 4 6 8 10 12 14 16 Retention Time (min) Mikolajczyk et al, Urology, 2000; 55: 41-5.

APLILSR-PSA (nativní proPSA) Co je proPSA ? Prekurzor, inaktivní PSA APLILSR-PSA (nativní proPSA) [-7]pro (7 aminokyselin - pro – vedoucí peptid)

Několik forem proPSA APLILSR-PSA (nativní proPSA) [-7]pro SR-PSA (zkrácené) APLILSR-PSA (nativní proPSA) [-7]pro ILSR-PSA (zkrácené) [-4]pro

Formy PSA rozdělené pomocí HPLC [-4]proPSA [-2]proPSA [-5/-7]proPSA Fluorescence (232 nm ex / 334 nm em) BPSA 2 4 6 8 10 12 14 16 Retention Time (min)

Molekulární formy PSA PSA volné PSA proPSA BPSA inPSA NH NH NH COOH Lys182 NH 2 clip 2 NH 2 Active Site Pro Lys145 COOH clip COOH COOH COOH AK 237 239-244 237 232-237? Komplex + - - - Onemocnění * benigní Nádor BPH *aktivní PSA není přítomno v séru Mikolajczyk et al, Urology 2002; 59: 797-802.

Typické zastoupení forem volného PSA u nádorového onemocnění Sérum s PSA 4-10 ng/ml intaktní ne-nativní PSA 39% volné PSA 15% proPSA 32% Komplex PSA BPH-A 28% Mikolajczyk et al; AACC Poster 2005

Volné PSA je směs! PSA 39% proPSA 32% BPH-A 28% intaktní ne-nativní PSA 39% [-2]proPSA 6% volné PSA 15% [-4]proPSA 10% proPSA 32% [-5/7]proPSA 17% BPH-A 28% BPH-Ag: nativní zralé PSA se 2 štěpeními u Lys182 a Lys 145 pPSA: [-7]proPSA (nativní pPSA) [-4]proPSA (zkrác.)  [-2]proPSA (zkrác.) Mikolajczyk et al; Meeting of the Keio Medical Society, Tokyo, 2002.

Jednotlivé formy PSA jsou asociovány s: symptomatickou BPH léčenou BPH léky objemem prostaty detekcí nádoru agresivitou nádoru metastázemi léčbou nádoru

Možné role PSA v patogenezi nádoru PSA štěpí IGFBP-3 (insuline-like growth factor binding protein 3) a uvolňuje IGF-1, který je růstovým faktorem KP Štěpení extracelulárních matrixových glykoproteinů (fibronectin, laminin) usnadňuje vznik metastáz Aktivace plazminogenového aktivátoru urokinázového typu usnadňuje vznik metastáz Proteolytická modulace osteoblastů (podporuje metastázy do kostí) Antiangiogenní aktivity – potlačení tvorby kapilár v diferencovaném nádoru

Je PSA specifický pro prostatu ? PSA také v mléčné, potní, periuretrální, anální žláze a děložní sliznici Zvýšený PSA při tumorech mléčné a slinné žlázy PSA v mateřském mléce, amniotické tekutině a mozkomíšním moku (75 % volný PSA) Zdroje mimo prostatu produkují málo PSA !

Celkový PSA jako tumorový marker časného záchytu KP PSA je tkáňově specifický (tkáń prostaty) hodnotu koncentrace PSA zvyšují: benigní hyperplazie prostaty,akutní zánět prostaty, ischemie prostaty, infarkt prostaty PSA nemá dostatečnou specifitu pro detekci KP u hodnot PSA <10 mg/ml

Ideální tumorový marker pro karcinom prostaty 100% Specifita 100% Sensitivita | | | | | | | | | | | | 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 100.0  Zdraví + benigní onemocnění Karcinom prostaty CUTOFF Ng/mL Ideální tumorový marker by měl jasně diferencovat mezi benigním a maligním onemocněním. Takový marker by měl 100% senzitivtu a 100 % specifitu.

Realná situace při stanovení PSA 20% Falešná NEG. 70% Falešná POZITIVITA | | | | | | | | | | | | 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 100.0  Zdraví + benigní onemocnění Karcinom prostaty CUTOFF PSA ng/mL PSA je spíše orgánově specifický než tumor specifický marker. Reálná situace: Při cutoff 4.0 ng/mL, je zřetelný překryv mezi pacienty s karcinomem prostaty a benigním onemocněním. Jenom čtvrtina pacientů s PSA >4 ng/mL má rakovinu prostaty. 30 – 50% jsou benigní pnemocnění prostaty se zvýšenými hodnotami. 20% ze všech pacientů, kteří mají PSA hodnoty menší než <4 ng/mL má rakovinu prostaty.

Přínos PSA po diagnostiku a léčbu KP PSA je citlivější než: celková ACP, prostatická ACP, kostní ALP PSA vynikající při predikci kostních metastáz PSA < 10 μg/l - metastázy nepravděpodobné nicméně < 1 % pacientů s normálním PSA má metastázy ! PSA po úspěšné radikální prostatektomii : po 3 týdnech neprokazatelné po 6 měsících < 0,4 μg/l

Metody zvyšující PSA Sensitivitu/Specificitu PSA Density (PSAD) PSA Velocity (PSAV) Věkově-specifické Referenční intervaly PSA – doubling time (PSADT) Free PSA/Total PSA (Index % Free PSA) Izoformy PSA Bylo podniknuto mnoho pokusů k zlepšení senzitivity a specifity testování pomocí PSA. Protože PSA je zvýšeno u 30 – 50% mužů s benigním onemocněním prostaty a u více než 20% mužů s karcinomem prostaty jsou hodnoty PSA nízké, byl zkoušeno zlepšení senzitivity a specifity pomocí PSA Density, PSA Velocity. Věkově specifických referenčních intervalů a % volného PSA.

PSA Density PSA: 8.0 ng/mL PSA: 8.0 ng/mL Objem: 80 cm3 Objem: 40 cm3 Jestliže vezmeme dva pacienty se stejnou hodnotou PSA 8.0 ng/mL a jeden má prostatu dvakrát větší v objemu, projeví se to v hodnotě PSA Density. Brawer, M. CA Cancer for Clin., 45:148-164, 1995.

Time prior to diagnosis (years) PSA Velocity Time prior to diagnosis (years) Serum PSA (ng/mL) n = 54 PSA velocity je jiná metoda zvýšení senzitivity PSA stanovení. PSA velocity je používána k předpovědi zda se u muže vyvine karcinom prostaty monitorováním rychlosti změny hladiny PSA v čase. PSA velocity větší než 0.75 ng/mL za rok předpovídá karcinom prostaty. A. Partin, J. Oesterling, J Urol, 152:1358-1368,1994.

Věkově definovaný referenční interval Věk Koncentrace PSA (ng/ml) 40 - 49 0 - 2,5 50 - 59 0 - 3,5 60 - 69 0 - 4,5 70 - 79 0 - 6,5 Referenční rozmezí celkového PSA pro jednotlivé věkové kategorie podle Oesterlinga. Většina urologů využívá toto věkově specifické rozmezí. Zlepšuje se senzitivita u mladších mužů (správná pozitivita) a zvyšuje se specifita u starších mužů (správná negativita). Oesterling a spol.

Doba ke zdvojnásobení hodnoty PSA Schmid 1993: Výhody PSADT vůči PSA: nezávislost na první měřené hodnotě nezávislost na způsobu analýzy Příklad Proměnná Jednotka Pacient A Pacient B Nárůst PSA za 1 r Rychlost růstu PSA Doba zdvojnásobení PSA μg/l μg/l za 1 r roky 3,64,4 0,8 3,5 7,68,4 6,9

Index fPSA/PSA Poměr Free/Total PSA = index volného PSA Nižší hognoty indexu volného PSA ukazuje na karcinom prostaty Vyšší hodnota indexu volného PSA ukazuje na BHP Pomoc klinikům při diferenciální diagnostice benigního a maligního onemocnění prostaty Poměr volné PSA k celkovému PSA se vyjadřuje v % a vypočítává se podělením obou hodnot. Nízké hodnoty % Free PSA předpovídají karcinom prostaty. Vyšší hodnoty % Free PSA předpovídají naopak benigní onemocnění prostaty. Již předběžné výsledky ukazovali na potenciální možnost zpřesnění diferenciální diagnostiky mezi benigním a maligním onemocněním prostaty.

Klinická užitečnost Indexu volného PSA Lepší možnost diferencovat mezi benigním onemocněním a nádorovým onemocněním prostaty Zlepšená citlivost Snížení falešně negativních výsledků a lepší detekce nádorů prostaty Zlepšená specifita Snížení falešných pozitivit a snížení počtu negativních biopsii Koncentrace volného PSA umožňují klinikům lépe diferencovat mezi benigním a maligním onemocněním prostaty. Koncentrace volného PSA zlepšují senzitivitu testování PSA redukováním falešně negativních výsledků a detekcí více malignit. Koncentrace PSA zlepšují specifitu stanovení PSA redukcí falešně pozitivních hodnot PSA stejně jako negativních biopsií.

Kdo je kandidátem na stanovení indexu fPSA/PSA | | | | | | | | | | | | 0.0 1.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 100.0  Zdraví + benigní onemocnění Karcinom prostaty CUTOFF PSA ng/mL Referenční interval 4-10 ng/mL 2.0 3.0 4.0 10.0 3-10 ng/mL (?) 2-10 ng/mL (?) Kadidáty na použití volného PSA jsou především pacienty jejichž hodnoty celkového PSA leží v intervalu 4 – 10 ng/mL. Užitečné je však také použití free Psa pro pacienty s hodnotami v intervalu 2 – 4 ng/mL, lepší detekce rakoviny.

Interpretace indexu fPSA/PSA 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Zvýšená pravděpod. benigního onemoc. Zvýšená pravděpod. karcinomu prostaty % Free PSA může zlepšit senzitivitu testů PSA redukcí falešně negativních hodnot a zlepšením detekce rakoviny. % Free PSA může rovněž zlepšit specifitu redukcí falešných pozitivit a redukcí nebo eliminací nadbytečných biopsií. % Free PSA je nástroj pro urology k získání dalších informací o pacientovi, zejména o pravděpodobnosti přítomnosti rakoviny prostaty, Na tomto základě může být provedeno vhodné rozhodnutí o léčbě pacienta. L. Killingsworth Ph.D.

Index fPSA/PSA u BHP, CaP a zdravých Diagnóza fPSA/PSA (%) Zdravý 27±16 BHP 20 ±11 KP 13 ±12

Index fPSA/PSA - eliminace zbytných biopsií

Index fPSA/PSA – Cut off Při nastavení na hodndotu 26% Senzitivita testu je 94.4% Eliminace zhruba 29% zbytných biopsií. Definitivním potvrzením CaP je histologický nález The cutoff from the clinical studies for % free PSA was fixed at 26% and resulted in a sensitivity of 94.4%. Using this fixed cutoff of 26%, for patients with a total PSA value between 4 to 10 ng/mL and a non-suspicious DRE, would potentially eliminate almost 29% of unnecessary biopsies.

Srovnání ROC pro Index fPSA/PSA a celkové PSA celkovél PSA index fPSA/PSA p Area Under Curve (AUC) 0.4715 0.7587 <0.0001 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 index fPSA/PSA celkové PSA Assay: 1 – Specifita (%) citlivost (%) Zde jsou prezentovány Receiver Operating Characteristics (ROC) křivky pro index % Free PSA a Total PSA. Tato data demonstrují signifikantní zlepšení schopnosti diferencovat mezi DRE negativními subjekty s karcinomem prostaty a těmi, kteří karcinom prostaty nemají, zavedením indexu % Free PSA pro rozsah celkového PSA mezi 4 a 10 ng/mL. Area under the curve (AUC) pro index % Free PSA je 0.7604, což je signifikantně více než 0.4816 pro Total PSA. Vessella, et al., Urology, 55:909-914, 2000.

Pravděpodobnost výskytu karcinomu: PSA 4-10 ng/mL 60 50 40 % pravděpodobnosti KP 30 20 10 0-10% 10-15% 15-20% 20-25% >25% %volného PSA - PSAI

Molekulární Izoformy PSA zlepšují časnou detekci a detekci agresivity nádoru prostaty

Daniel Chan, Johns Hopkins, Baltimore, USA BPSA PSA volné pPSA PSA~ACT jiné (1980) (1990) (2000) Advances in understanding of what PSA molecule is. BPSA is the nicked form, with proteolytic clips at lys145, lys182. This changes the conformation of the protein. pPSA is the pro-form of the ‘enzyme’. ‘others’ are inactive forms of the molecule. Daniel Chan, Johns Hopkins, Baltimore, USA

% proPSA: zvyšuje se při nádoru % inPSA: snižuje se při nádoru Zastoupení forem PSA: % proPSA: zvyšuje se při nádoru % inPSA: snižuje se při nádoru % BPS-A: snižuje se při nádoru Celkové % volného PSA: klesá s nádorovým onemocněním

[-2]proPSA

Užitečnost nových izoforem PSA BPS-A nerozlišuje mezi BPH and KP Mikolajczyk 2004, Linton 2003 [-2]proPSA Se výrazně zvyšuje u KP v séru ve srovnání s BPH sérem %[-2]proPSA ([-2]proPSA/fPSA) lepší detekce KP u tPSA v rozsahu 4-10 a 2-10 ng/ml diskriminuje KP od BPH jestliže v séru je fPSA>25% projevuje se ve vztahu ke Gleason skóre >7 a extrakapsularní extenzi tumoru Mikolajczyk 2001 and 2004, Catalona 2003 and 2004

Rotterdamská-Innsbrucká Studie Department of Urology Ron van Schaik Joep Kurstjens Monique Roobol Mark Wildhagen Chris Bangma Retrospektivní měření Total PSA Free PSA BPS-A [-2]proPSA Beckman Coulter Access Immunoassay Cross-validation Department of Urology W. Horninger H. Klocker J. Bektic G. Bartsch

Poměr klinické specificity při 90% klinické senzitivitě 0,5 1 1,5 2 Specificity ratio tPSA fPSA %[-2]proPSA

PSA Izoformy u KP- detekční účinnost vztažena k % volného PSA Poměr klinické specifity při 95% klinické senzitivitě (celkové PSA mezi 2 and 10 ng/ml) PSA %volnéhoPSA %[-2]proPSA* %[-2]proPSA Index* 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Poměr specifity * ve vývoji

Závěry studií: [-2]proPSA má klinickou hodnotu %[-2]proPSA je nejlepším individuálním prediktorem KP (univariační analýza) přidání [-2]proPSA zvyšuje účinnost detekce výskytu KP

Závěr: Časná detekce a monitorování KP vyžaduje zlepšení diagnostických prostředků Sextantová biopsie prostaty nahrazována multiplikovanou biopsií (minimálně by mělo být odebráno 18 vzorků perïferní i tranzitorní zóny) – zlepšení diagnostické výtěžnosti Nová koncepce hodnocení histologie z biopsie prostaty (2005)

Závěr: Další nové markery přispívají ke zlepšení diagnostiky KP Cirkulující nádorové buňky KP – technologie RT-PCR Prostate Cancer Gen3 – PCA3 EPCA-2 – sérový marker – patentovaný R.Getzenberg – University of Pittsburg, Joh Hopkins University

Závěry: PSA přes své zřejmé limity zůstává zlatým standardem jako nádorový marker KP PSA je snadno dostupné vyšetření, které vede k detekci KP ve fázi lokalizovaného, tedy kurabilního stadia onemocnění Odvozené parametry PSA (PSAD, PSAV, věkově specifické intervaly PSA, volné PSA a jeho izoformy, PSADT) přispívají k odlišení KP od jiných onemocnění prostaty Nemocným s abnormálním palpačním nálezem a normálním PSA nebo po invazivní terapii BPH provést biopsii, protože u některých nemocných nedochází ke zvýšení PSA Hledat do budoucna další a lepší onkomerkery KP