Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Neinvazivní prenatální diagnostika na bázi přítomnosti fetální DNA v mateřské cirkulaci Neinvazivní RHD a RHCE genotypizace plodu Aloimunizace, fetální erytroblastóza, hemolytické onemocnění novorozence Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3. LF UK

fetomaternální inkompatibilita krevních skupin

Fetální erytroblastóza a hemolytické onemocnění novorozence Aloimunizace – tvorba mateřských protilátek proti antigenům červených krvinek plodu Placentární přestup IgG Destrukce fetálních erytrocytů → Inkompatibilita v RhD systému nejčastěji způsobuje fetální erytroblastózu a HON Izoimunizace – starší výraz

Nejvýznamnější aloprotilátky Anti-D aloprotilátky Anti-Kell aloprotilátky Kell systém – 24 antigenů K1 (K; Kell) x K2 (k; Cellano) K – nejvíce imunogenní a 2. nejčastěji způsobuje HON, u 9% populace Imunizace obvykle po transfuzi Kell-poz. krve Kell-negativní ženě Colour Atlas of Immunology

Nejvýznamnější aloprotilátky Anti-c, anti-E, anti-C, anti-e Aloprotilátky x ostatním Ag krevních skupin Lewis (Lea, Leb) Duffy (Fya, Fyb) Kidd (Jka, Jkb) MNSs (M, N, S, s, U) Diego (Dia, Dib) Lutheran (Lua, Lub) AB0 inkompatibilita (žena 0, muž A anebo B; tvorba anti-A, anti-B IgG, vzácně intrauterinní hemolýza, postnatálně hyperbilirubinémie, riziko vzniku jádrového ikteru)

Erytrocytární antigeny E. Sjoberg-Wester; Jill Storry

Variantní RhD antigeny RHD gen – řada variant V ČR nejčastěji varianty D VI, DFR, D VII, DCS Přeskupení mezi RHD a RHCE geny, bodové mutace Frekvence výskytu – asi 1% v kavkazské populaci RhD variantní protein – absence 1 či více epitopů v porovnání s normálním RhD → žena laboratorně RhD pozitivní, ale může tvořit anti-D protilátky proti „chybějícím epitopům“ Každá žena s variantním RhD proteinem - považována za RhD negativní, vzácně může vzniknout HON

Slabé RhD antigeny Snížení exprese RhD proteinu (slabý RhD, Du) na povrchu krvinky, ale s víceméně zachovaným „repertoárem“ D epitopů (až serologicky Rh negativní při stopové Rh pozitivitě) Pacientky se slabým RhD antigenem – nebudou tvořit anti-D protilátky, dítě není ohroženo HON Profylaxe není nutná

Senzibilizace mateřského IS Nekompatibilní krevní transfuze V předchozím těhotenství, průnik fetálních buněk do mateřské cirkulace během Invazivního zákroku (CVS, AMC, kordocentéza) Potratu Porodu Krvácení během těhotenství

RhD aloimunizace Colour Atlas of Immunology

Prostup protilátek přes placentu Aktivní transport IgG (všechny 4 podtřídy) aloprotilátek přes placentu Přes buňky syncytiotrofoblastu Transport protilátek – nízký přibližně do 20. týdne, poté exponenciální nárůst 30. týden – ½ sérové [IgG] matky porod: [IgG] v cirkulaci plodu až o 10% více než v séru matky

Prostup protilátek přes placentu IgG – transcytóza přes buňky syncytiotrofoblastu 1. aktivní proces přes receptory 2. pinocytóza Fúze váčků, v endozómu ↓ pH – vazba na FcRn (IgG nenavázané - degradace v lysozómech) Exocytóza na bazální straně, difuze do cirkulace plodu

HON Colour Atlas of Immunology ADCC – na protilátkách závislá buněčná cytoxicita, NK buňky a fagocyty Fc receptor pro IgG – rozpoznání buněk označených Xlátkami, likvidace cytotoxickými mechanismy. Imunopatologická reakce založené na cytotoxických protilátkách – reakce typu II IgG způsobují reakci typu ADCC (na protilátkách závislá buněčná cytotoxicita) → lýza fetálních erytrocytů slezinnými makrofágy, IgG vs Ag KS

Imunopatologická reakce založená na protilátkách IgG a IgM

HON 3 stupně: Anemia neonatorum – hodnoty Hb a Ht nízké Icterus neonatorum (závažnější stupeň anémie, hepatosplenomegalie, neléčený ikterus – bilirubinová encefalopatie) Hydrops fetus universalis (generalizované prosáknutí tkání a přítomnost transudátu v tělních tekutinách, s velmi špatnou prognózou)

Sledování senzibilizovaného těhotenství Plod ohrožen anémii – pozitivní nepřímý antiglobulinový (Coombsův) test Detekce 1 nebo více protilátek v séru asoc. s HON v séru matky Colour Atlas of Immunology

Měření mateřských protilátek První screening přítomnosti protilátek mezi 10. – 12. týdnem u všech těhotných Vyšetření krevních skupin matky Negativita – opakování ve 24. a 32. týdnu Pozitivita, určení specificity a titru protilátek 1:8 a vyšší – každý měsíc opakovat vyšetření titr 1:16 až 1:32 (1:16 a vyšší pro anti-D protilátku; 1:8 pro Kell protilátku) → nutná další vyšetření Pozn.: Titr protilátek - nejvyšší ředění séra pacientky, při kterém ještě pozitivní výsledek nepřímého Coombsova testu 1:32 = poz. výsledek při ředění, další ředění negativní 1 díl sérum : 32 dílů vody

Sledování těhotných žen s rizikem RhD aloimunizace Protilátky přítomny (nepřímý Coombsův test pozitivní) Neinvazivní stanovení RhD statusu Antigenní výbava otce homozygot Heterozygot, 50% pravděpodobnost RhD pozitivity dítěte RhD negativní RhD pozitivní

Určení RHD faktoru u plodu neinvazivně U anti-D aloimunizovaných RhD negativních těhotných žen s rizikem HON RhD negativita – delece RHD genu v kavkazské populaci

RhD negativita u ostatních etnik RHD (pseudogen) Inaktivní kompletní RHD gen, 37-bp inzerce exon 4 (PCR) + 1-2 předčasné stop kodony v exonu 6, předčasná terminace translace, 0 HON 66% černošské populace , 27,7% Japonců a11% Brazilců Hybridní RHD-CE-D gen RhD negativní fenotyp: 3´ konec exonu 3 a exony 4-8 RHCE genu, RHD exon 10 +, exon 7 – (PCR) Weak C, VS+, Afričané (3%)

RHD u anti-D aloimunizovaných těhotenství v riziku fetální erytroblastózy a HON Pro spolehlivou RHD genotypizaci – nutné analyzovat více oblastí RHD genu Nejčastěji kombinace exonu 7 a 10 nebo exonu 7 a 5 Nutné zohlednit etnickou populaci (výskyt alterací RHD genu) + ideálně vyšetření krevní skupiny obou rodičů

RHD u anti-D aloimunizovaných těhotenství v riziku fetální erytroblastózy a HON (ČR) U nás - kombinace exonu 7 a 10 100 % specificita a 100 % senzitivita u detekce RHD exon 7 a exon 10 RhD negativní plody u aloimunizovaných těhotenství nejsou ohroženy HON, u pozitivních plodů včasná informace pro klinika

Neinvazivní RHCE genotypizace určení C/c alely u plodu U anti-c aloimunizovaných CC homozygotních těhotných žen s rizikem HON Určení přítomnosti Rhc alely u plodu U anti-C aloimunizovaných cc homozygotních žen s rizikem HON Určení přítomnosti RhC alely u plodu

Neinvazivní RHCE genotypizace určení E/e alely u plodu U anti-E aloimunizovaných ee homozygotních těhotných žen s rizikem HON Určení přítomnosti RhE alely u plodu U anti-e aloimunizovaných EE homozygotních žen s rizikem HON Určení přítomnosti Rhe alely u plodu

RHCE genotypizace plodu SNP exon 2 (Rhc) Specifická inzerce intron 2 (RhC) SNP exon 5 (RhE/Rhe)

RHCE genotypizace plodu (ČR) 100 % specificita a 100 % senzitivita u detekce RHD exon 7 a exon 10, RHCE (C alela) 100 % specificita a 95 % senzitivita u RHCE (c alela a E alela) genotypizace (SNP), někdy problém - většina DNA je mateřského původu Negativní plody u aloimunizovaných těhotenství nejsou ohroženy HON, u pozitivních plodů včasná informace pro klinika

Závažnost senzibilizace Nelze určit pouze z titru protilátek, závisí na Specificitě, koncentraci, aviditě a IgG podtřídě protilátky Síle exprese cílového antigenu na krvinkách plodu (slabé RhD antigeny) Gestačním stáří plodu v období, kdy hladina protilátek dosáhne kritických hodnot (ne)přítomnosti „blokujících“ protilátek v séru matky Schopnosti retikuloendotelového systému destruovat senzibilizované erytrocyty → Proto nutná další vyšetření: sledování UZ, dopplerovská flowmetrie, kordocentéza

Diagnostika fetální anémie Spektrofotometrické měření plodové vody na bilirubinoidní barviva – sériové AMC Od tohoto vyšetření se již ustoupilo – provedení AMC ještě prohlubuje aloimunizaci + další rizika Vyšetření ultrazvukem Zjišťování známek rozvoje kompenzatorní reakce (hepatosplenomegalie), vytvoření ascitu, zjištění iniciálního hydropsu Liley's system [2,3] of predicting severity of fetal disease, based on the deviation in optical density at a wavelength of 450 nm in amniotic fluid (DeltaOD450), has become the best known. Liley proposed three zones to delineate severity of disease. Values in the high zone indicate severe disease. Values in the low zone indicate mild or no disease. For the mid zone values measurement needs to be repeated to determine the trend [3]. Liley's method pertains only to pregnancies from 27 weeks to term. Many other methods extended the Liley zones before 27 weeks, usually without sufficient data to substantiate the earlier zones. Unfortunately, the clinical experience from extending zones earlier by extrapolation has been problematic. As a result, investigators [9] have questioned whether Liley charts are still useful. Amniotic fluid DeltaOD450 analysis effectively predicts fetal condition in the third trimester [2,3,4,5,6,7,8]. It also has practical value in the second trimester [10,11]. In this report we will present our experience with analysis of amniotic fluid DeltaOD450 through both the second and third trimesters. Bilirubin z rozpadlých erytrocytů přestupuje propustnou hematoencefalickou bariéru a poškozuje bazální ganglia (jádrový ikterus) Queenan et al., 1993

Diagnostika fetální anémie Dopplerovské měření maximální průtokové rychlosti v arteria cerebri media na vrcholu systoly Při anémii – pokles viskozity krve s následným zvýšením výdeje a rychlosti krevního toku v cévách plodu Dopplerovská velocimetrie umožňuje vyjádřit vztah mezi hodnotou fetálního hemoglob. a rychlostí průtoku krve v arteria cerebri media Asi nejlepší marker Doubek a kol., 2005 Kenneth, 2004

Diagnostika fetální anémie Kordocentéza Nejpoužívanější a nejbezpečnější metoda přístupu k fetální cirkulaci Hlavní metoda invazivní diagnostiky – často předchází výkonu terapeutickému – intrauterinní transfuze Možnost stanovení Rh faktoru plodu a krevního obrazu Až od 20. týdne, nevhodná po 34. týdnu

Léčba 2 terapeutické alternativy: Intrauterinní transfuze (5% riziko) Předčasný porod Gestační stáří Stav zralosti plic plodu Celkový stav plodu (z biofyzikálního profilu) ↑ gestační stáří - ↓ postnatální riziko Před 32. t. – IU transfuze

Terapie anemického plodu – Intrauterinní transfuze Poprvé úspěšně v roce 1963 Převažuje intraumbilikální transfuze bez výměny (doplňovací transfuze) za kontroly UZ Není shoda na cílovém hematokritu – 40 – 65% pozor – při hematokritu nad 50% - ↑ viskozita krve, hypoxie v některých orgánech plodu Častá komplikace – přechodná těžká bradykardie Doporučení Hájek a kol.: erytrocytární transfuzní přípravky s Hct 80 – 85% → cílový Hct plodu 40 – 45% Hematokrit – 38% ženy, 46% muži

Terapie anemického plodu – Intrauterinní transfuze Lépe až od 20. t. do 34. týdne Interval 7-10 dní (zkrácení intervalu u plodu s hydropsem) Ukončení gravidity 2-3 týdny po poslední transfuzi 36-37. t., obvykle SC Hematokrit – 38% ženy, 46% muži

Poslední transfuze a ukončení těhotenství Opakované intraumbilikální transfuze, poslední nejpozději ve 34. - 35. týdnu, porod mezi 37. – 38. t. nejčastěji SC Intrauterinně vznikající bilirubin z velké části vylučován placentou x novorozenecká játra nejsou schopna zvýšený odpad bilirubinu konjugovat - vzestup nepřímého bilirubinu, hromadění v bazálních gangliích → jádrový ikterus - bilirubinová encefalopatie Aplikace fenobarbitalu (30 mg denně, 10 dní před porodem) – zlepšení zpracování bilirubinu ve fet. játrech N

Porod Ihned z pupečníkové krve stanovit: Hodnoty pH a krevních plynů Krevní skupinu a Rh faktor Hemoglobin a hematokrit Opakovaná kontrola bilirubinu Retikulocyty Protilátky anti-D – přímý Coombsův test Fototerapie, výměnná transfuze Po opakovaných IUT – novorozenec má obvykle mírnou až střední anémii, ikterus lze často zvládnout fototerapii bez výměnné transfuze. Největší problém – pacientky s opakovaným imunitním hydropsem před 20. t. gravidity – v době před možností účinné léčby Po opakovaných IUT – novorozenec má obvykle pouze mírnou až střední anemii, ikterus lze často zvládnout fototerapií bez výměnné transfuze Největší problém – pacientky s opakovaným imunitním hydropsem plodu před 20. týdnem těhotenství – tedy v době před možností účinné léčby intraumbilikální transfuzí

Rh aloimunizace V 50. letech – každá 2. aloimunizovaná žena přišla o své dítě Závažný problém až do 70. let, závažná příčina perinatální mortality a morbidity Díky RhD profylaxi u RhD negativních žen – dramatické snížení úmrtnosti plodů a novorozenců Přesto se ale nedaří Rh aloimunizaci předejít zcela – i nadále závažné riziko Neúmyslné opomenutí po porodu Nepodání léku při jiné prenatální indikaci Nedostatečné dávkování při porodu v případě rozsáhlého fetomaternálního krvácení V 50. letech – každá 2. aloimunizovaná žena přišla o své dítě

Profylaxe RhD aloimunizace Podání IgG anti-D protilátky, poločas rozpadu ~16 dní Program zahájen v 60. letech Snížil výskyt Rh senzibilizace z 8% na 0,8% všech těhotenství Preparát Partobulin, Rhega Nutné do 72h po porodu anebo senzibilizující příhodě Po porodu: zpravidla 250 – 300 μg intramuskulárně (20 μg anti-D – zneutralizuje 1 ml RhD pozitivní krve) Při větším krvácení (SC, porod s předčasným odlučováním lůžka,..) – nutné dávku anti-D zvýšit na 500 μg i.m. Kleihauerův-Betkeho test (kvantifikace krvácení) Pouze pokud není pacientka senzibilizovaná Žádné anti-RhD protilátky v MK, žádné v pupečníkové krvi

Profylaxe RhD aloimunizace Zabrání senzibilizaci mateřského IS Podání anti-D protilátek – blokace Ag Plod (D) matka (d) IgG-anti-D (profylaxe) Zábrana tvorby protilátek, hemolýza

Profylaxe RhD aloimunizace Kromě odstranění fetálních erytrocytů (žádná aktivace B lymfocytů) aktivní suprese B lymfocytů imunokomplexy RhD antigenů s navázanými protilátkami agregace BCR a Fc receptorů Hořejší a Bartůňková, 2001

Profylaxe RhD aloimunizace Podání preparátu vždy: Po porodu RhD pozitivního dítěte Po přerušení těhotenství anebo spontánním potratu Po mimoděložním těhotenství Po zákrocích v těhotenství, které jsou spojeny se zvýšeným rizikem fetomaternálního prostupu erytrocytů (invazivní vyšetření) Při krvácení kdykoliv v průběhu gravidity (tupý náraz do břicha, obrat plodu zevními hmaty) Po chybné transfuzi RhD pozitivní krve

Profylaxe RhD aloimunizace Ve 28. týdnu jako profylaxe proti poměrně malému riziku senzibilizace v pozdním těhotenství ??? (ČGPS ČLS JEP) 1% riziko RhD aloimunizace u RhD negativních žen v průběhu prvního těhotenství a bezprostředně po porodu Rh(D) pozitivního dítěte 0,2% po antenatálním podání 100 μg anti-D ve 28. a 34. týdnu gravidity Význam NIPD – pokud dítě Rh negativní, žádná profylaxe

Riziko profylaxe Mateřské komplikace nejsou známy Krevní preparát – z krve dárců s ↑ anti-D Nejčastější riziko – vyvolání hemolytické anémie u plodu, průchod placentou, destrukce fetálních erytrocytů ALE dávky velice nízké, riziko poškození malé dnešní technologie přípravy téměř vylučuje riziko přenosu virových partikulí (HIV, HBV, CMV)