Přednáška II Replikace DNA DNA replikace Replikace chromozómu u bakterií Replikace lineárních chromozómů u eukaryot Replikace plasmidů

DNA replikace Veškeré buňky musí duplikovat svou DNA předtím než se rozdělí

DNA replikace DNA musí být rozdělena na 2 vlákna Každé vlákno je replikováno (původní vlákno slouží jako templát) – replikace je semikonzervativní Watson-Crick párování (A s T, G s C)

Meselson-Stahl pokus 1958 „ the most beautiful experiment in biology“ 3 teorie, jak je DNA replikována Semi-konzervativní Konzervativní Disperzní

Meselson-Stahl pokus 1958 „ the most beautiful experiment in biology“ 3 teorie, jak je DNA replikována Semi-konzervativní Konzervativní Disperzní

Meselson-Stahl pokus Tím, že je lehký řetězec detekován, nemůže být tato teorier pravdivá Těžký řetězec není detekován, Tato teorie není pravdivá

Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo linearní) Chromozómy - kruhové Chromozómy - lineární Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární) Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Obecný mechanismus replikace Původní vlákno slouží jako templát V 60. letech – pozorování replikující se DNA, tvoří písmeno Y – REPLIKAČNÍ VIDLIČKA Replikační multienzymatický komplex obsahující DNA polymerázu

Obecný mechanismus replikace DNA polymeráza (DNAP) byla objevena v roce 1956 A. Kornbergem (E.coli) Vždy ve směru 5‘  3‘ 1960 – radioaktivní thymidine, na pár sekund, existence krátkých úseků DNA (1000 – 2000nt) Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp u prokaryote) Vedoucí (leading) vlákno vs opožďující se (lagging strand) vlákno

Obecný mechanismus replikace Replikace vždy ve směru 5´  3´ Reakce je hnaná uvolněnou energíí z dNTP, PPi se rozpadá na jednotlivé molekuly fosfátu

Obecný mechanismus replikace Korekturní aktivita – proofreading activity Chyba pouze na každých 109 bazí 3´  5´ exonukleázová aktivita Nachází se na jiné podjednotce, či doméně DNAP Tato aktivita odštípne veškeré nukleotidy, které nejsou dobře spárované Tato aktivita vyžaduje perfketně spárovaný začátek

Korekturní aktivita je důvod proč polymerizace probíhá pouze ve směru 5‘ ku 3‘.

Obecný mechanismus replikace DNA polymeráza potřebuje RNA primer Pro vedoucí vlákno je nutný pouze 1 primer Pro opožďující vlákno jsou nutné primery kdykoliv DNAP dokončí Okazakiho fragment (během sekundy) DNA primáza Používá NTP, u eukaryot jsou 10 bazí dlouhé DNAP polymerizuje dokud nenarazí na další RNA primer Proč RNA primer a ne DNA primer ? Mutace, rozpoznání RNA/DNA 10nt/200bp  5% genomu

Obecný mechanismus replikace RNA primery jsou nakonec odstraněný exonukleázovou aktivitou DNAP I a nahrazeny dNTPs DNA polymeráza – reparační (RNase H) rozeznávající DNA/RNA segmenty DNA ligáza vytvoří kovalentní vazbu mezi dvěma sousedními nukleotidy

Komplex replikační vidličky Proteiny, které se účastní replikace DNA gyráza Helikáza ATP dependentní, 1000bp/s Single-strand binding protein (SSBP) Stabilizují ssDNA, prevence krátkých vlásenkových struktur DNA polymerase Ráda se odpojuje od DNA Komplex pohybující se svorky (sliding clamp) Váže DNAP Nezabraňuje rychlému pohybu DNAP Jakmile narazí na dsDNA, DNAP se odpojuje

Komplex replikační vidličky

Komplex replikační vidličky

Replikační proteiny v E.coli FUNKCE DnaA Váže se na počátek replikace (ori) Helicase Uvolňuje dsDNA DnaC Pomáha helikáze při vazbě na DNA SSBP Udržuje ssDNA Primáza Syntéza RNA primerů RNáza H Odstranění RNA primerů DNA polymeráza I Vyplňuje mezery mezi Okazakiho fragmenty DNA polymeráza II Reparační enzym DNA polymeráza III Hlavní replikační enzym (,,) Sliding clamp (,,,, ‘,,) DNA ligáza Liguje niky, zvlášte pak v lagging vláknu DNA gyráza  a  podjednotka, zavádí negativní supercoily Topoisomeráza IV Štípe a liguje dsDNA, uvolňuje pozitivní otáčky

Topologické problémy při replikaci DNA Rozpletení dvoušrobovice (800b/s) pomocí helikázy Oba řetezce je nutno oddělit a prootočit Chromozom nemůže jen tak rotovat Vzniklé napětí je uvolněno topoisomerázami (DNA gyrázou) DNA gyráza zavádí negativní superspiralizace a tím uvolňuje pozitivní superspiralizaci způsobenou helikázou

Replikace kruhovité molekuly Baktérie, E. coli genom je 4.6 106bp 2 replikační vidličky (-replikace) DNA replikace a buněčné dělení je synchronizováno

Iniciace replikace kruhovité molekuly Iniciace replikace v ori (oriC) Iniciační komplex obsahuje 5 proteinů: DnaA, DnaB (helikáza), DnaC, DNA gyrázu, SSB oriC obsahuje repetice 3x GATCTNTTNTTTT a 4x TTATNCANA Vazba DnaA proteinu Na rozvolněnou DNA se naváže DnaB a DnaC – začátek replikační vidličky Helikáza aktivuje primázu a tím pádem syntézu RNA primeru

Terminace replikace kruhové molekuly Ukončení replikace – Ter místa Replikace probíha v obou směrech (po směru a proti směru hodinových ručiček) TerC, TerB, TerF TerA, TerD, Ter E Vážou Tus proteiny Jejich delece jsou slučitelné se životek, replikační vidlička je nepotřebuje k ukončení replikace Separace spojených molekul toposiomerázou IV

Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo linearní) Chromozómy - kruhové Chromozómy - lineární Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární) Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Syntéza eukaroytické DNA Stejný princip jak u baktérií Replikační systém vyizolovaný ze savčí buňky – 80. léta Studie hlavně na kvasince Komplikovanější MCM – minichromosome maintenance DNAP  , ,  DNAP  - primase – iniciace replikace, syntetizuje primer, který pak produlužuje pomocí dNTPs – 20nt – iDNA RPA – replication protein A – chrání ssDNA RFC – replication factor C – váže se na iDNA, přibírá do komplexu posuvnou svorku (PCNA protein) + 2 DNAP DNAP  - přepisuje opožďující se vlákno DNAP  - přepisuje vedoucí vlákno PCNA - Proliferating cell nuclear antigen, homotrimer Regulační proteiny– Cdc45, GINS complex – neznámá funkce Primery jsou odstraněny pomocí exonukleázy Fen1 a/nebo Dna2 (rozdíl oproti baktériím) Mezery jsou dosyntetizovány DNAP  a spojeny pomocí DNA ligázy

Replikace lineárních chromozómů Lidský genom 150x106 bazí Rychlost replikace pouze 50bp/sec Mnoho počátků replikace U kvasinek cca každých 30 000 bazí, cca 400 počátků U lidských somatických buněk - mezi 10 000 až 100 000 počátků Obousměrná Replikační bublina Synchronizace každý chromozóm je replikován pouze jednou každý počátek prochází iniciací pouze jednou

Iniciace replikace Nejlépe studován u kvasinek ORC komplex (origin recognition complex) se váže na na počátek replikace a spouští řadu reakcí: Cdc6, Cdt1 a ORC a MCM (helicase) = pre-replicative complex (pre-RC) Tento komplex se formuje pouze v G1 fázi Pre-RC je aktivován kinázou S-CDK odpojují se Cdc6 a Cdt1 tím se aktivuje helikáza Spouští se replikace

Replikace lineárních chromozómů – nové nukleosomy Chromatin modelujicí proteiny – destabilizují vazbu histonů na DNA Náhodně zůstavají s dceřinnou, či původní DNA

Replikace lineárních chromozómů – nové nukleosomy Chromatin sbalujicí proteiny – pomáhají zabalit DNA zpět do nukleosomů

Replikace lineárních chromozómů - telomery Problém při replikaci lineárních chromozómů DNA polymeráza potřebuje primer Po odstranění RNA primeru dojde ke zkrácení DNA Telomery OPAKOVANÉ KRÁTKÉ SEKVENCE OBVYKLE 6 BÁZÍ TTAGGG – OBRATLOVCI TELOMERASE – PRODLOUŽÍ KONCE DNA O JEDEN TANDEM PROTEKCE PROTI EXONUKLEAZOVÉ AKTIVITĚ EXTRÉMNĚ KONZERVOVANÉ Buněčné hodiny

Replikace lineárních chromozómů - vyjímky Protein primery DNA polymeráza může použít volnou –OH skupinu aminokyseliny z proteinu, který se váže na konec chromozómu Tento protein také chrání DNA před degradací Systém používán některými viry a bakterií rodu Streptomyces (lineární chromozóm) Vlásenková struktura chrání konce DNA u Borrelia

Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo linearní) Chromozómy - kruhové Chromozómy - lineární Plasmidy – prokaryotické Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Plasmidy Kruhové molekuly DNA samostatně se množící Vyjímky jsou lineární plasmidy a RNA plasmidy (zjednodušené RNA viry) Parazitují na buněčném aparátu pro svou replikaci Přinášejí buňce určitou selekční výhodu Nemohou být bez buňky Vyskytují se v různém počtu (obvykle 1-2 plasmidy/chromozóm, ale až 50) Velikost plasmidu je velmi různá Plasmidy mohou nést gen zajišťující resistenci na antibiotikum Kryptické plasmidy (bez očividné funkce) F-plasmidy – specificke pro E.coli a baktérie rodu Shigella a Salmonela P-plasmidy – promiskuitní Transferability vs mobility

Obousměrná replikace Replikace valivou kružnicí

Stejný mechanismus replikace ukazuje na příbuzný vztah mezi plasmidy a viry ssDNA viry dsDNA viry

Mechanismus replikace plasmidu F - conjugation Nejstarší známý plasmid (byl náhodou přítomen v izolátu E.coli K12, Stanford, 1928) F - fertility Nízké copy number, 100kb Konjugativní vlastnosti Tra+ transfer positive plasmidy tra geny (nejméně 30 genů) F+ (donor) and F- (recipient) Některé malé plasmidy jsou tra-, ale mob+ (mohou být mobilizovány za přítomnosti Tra+ plasmidu) Bakteriální sex Obousměrná replikace (ori V) Konjugační most Replikace valivou kružnicí (ori T)

Přenos chromozomální DNA díky F-plasmidu Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (inserční sekvence) baktérie, které mají F plasmid v chromozómu - Hfr strains (high frequency chromosomal gene transfer) Celý chromozóm může být přenesen za 90 minut, často dojde k přerušení a pouze část chromozómu je přenesena F plasmid se umí vyštípnout z chromozómu, nese část chromozómu – F‘ prime plasmids

Antisense RNA jako kontrola počtu plasmidů v buňce High copy plasmid regulují svůj počet pomocí limitace startu replikace Low copy plasmid – striktní regulace, replikují se s replikací buňky Antisense RNA – studovaná pro plasmid ColE1 Iniciace replikace ColE1 Syntéze pre-primeru (555bp) – RNAII Je štípnut ribonukleázou H (volný 3‘-OH) Tento enzyme je specifický pro DNA:RNA DNA polymeráza pokračuje RNA I – 108bp, transkripce komplementárního vlákna

Závislost buňky na plasmidu Buňka přežije pouze v případě, že si udrží plasmid 2 komponenty produkované plasmidem: toxin (více stabilní) and protijed (méně stabilní) Protein-based operon F-plasmidu: CcdA (protijed) a Ccd B (toxin, inhibuje DNA gyrázu) RNA-based system: protijed je antisense RNA, která neumožňuje translaci toxinu (Host-killing protein – Hok and Sok antisense RNA)

Plasmidy s resistencí na antibiotika R plasmidy 1-2 kopie na buňku Objeveny během 2. svět. války v Japonsku Bacteria Shigella resistentní vůči sulfonamidům R plasmidy jsou transferu schopné Resistentní kmeny baktérií jsou velmi problematické Zákaz používaní lidských antibiotik na prevenci nákazy u zvířat Použití v genovém inženýrství

Resistance vůči -laktam antibiotikům Nejrozšířenější skupina antibiotik (penicilín, ampicilín, cephalosporin) Působí na buněčnou stěnu baktérií Reaguje s enzymem budující buněčnou stěnu, nedochází ke cross linku peptidoglycanu a dochází k disintegraci buněčné stěny Obsahují -laktam kruh Resistence díky enzymu -laktamázy (bla gen) Modifikace antibiotické struktury – více odolná na štěpení -laktamázou Administrace antibiotika + lactam analogu (clavulanic kyselina), který se váže na enzym a inhibuje ho Otevírá -laktamový kruh

Resistence to chloramphenicol Chloramphenicol, streptomycin a kanamycin Působí na bakteriální translaci (vážou se na 23S rRNA) Resistence: Chromozomální mutace ribosomálních proteinů – nedojde k inhibici pomocí antibiotika, ale sníží se efektivnost translace Plasmidová – chloramphenicol acetyl transferáza (CAT) Substituce za fluorine – resistentní vůči modifikaci Acetyl skupiny

Resistence na aminoglykosidy Streptomycin, kanamycin, neomycin Produkované půdními baktériemi rodu Streptomyces (sami si produkují resistenci-indukující enzym) Obvykle 3 cukerné kruhy, z nichž alespoň jeden nese aminokyselinu Vážou se na SSU ribozómu a inhibují translaci Inaktivace jejich aktivit pomocí modifikací (fosforylace, acetylace, adenylace) Resistence: neomycin phosphotransferase (npt gen) Derivát kanamycinu U – Amikacin – jeho acetylace schopný cukerný zbytek je blokován hydroxybutyratovou skupinu – i přes to již došlo k evoluci nové N-acetyl transferázy, která je schopna acetylovat tuto molekulu

Resistence vůči tetracyklinu Tetracyklin se váže na 16S rRNA a inhibuje translaci Inhibije prokaryotickou i eukaryotickou translaci (eukaryota ho aktive neimportují, spíše naopak, efektivně ho exportují) Resistence: Plasmid R kódující transporter, který umožnuje efektvní export tetracycklinu zpět do prostředí

Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo linearní) Chromozómy - kruhové Chromozómy - lineární Plasmidy – prokaryotické Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Ti plasmids Tumor-inducing (Ti) Přenos mezi baktérií a rostlinou Ti plasmid se nachází v baktérii Agrobacterium Část plasmidu je přenesena do rostlinné buňky pomocí procesu připomínající konjugaci Dojde k začlenění (náhodnému) do chromozómu a k expresi růstových hormonů – nádor a místo pro množení baktérie Ti oblast plasmidu obsahuje geny pro auxin (zvětšuje objem buňky), cytokin (indukuje replikaci buňky) a opin (zdroj energie pro bakéterii) Použití v genovém inženýrství Arabidopsis thalianna – 27 000 genů přerušeno pomocí Ti plasmidu – inaktivace genu – studium fenotypu Tumor DNA

2 plasmid kvasinek Kruhová molekula 6318bp (dsDNA) 50-100 kopií/haploidní genom Nachází se v jádře!, váže histony a formuje nukleozóm Použítí v genovém inženýrství – eukaryotický klonovací vektor Skladba: 2 obrácené repetice (rozdělují plasmid na 2774 a 2346bp) Flp rekombináza (flipáza) katalyzuje rekombinace, rozeznáva Frt místo Může dojít k inzercím, či delecím daných segmentů pokud jsou ohraničena Frt místy Flp/Frt systém je podobný Cre/loxP systému

Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo linearní) Chromozómy - kruhové Chromozómy - lineární Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární) Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Mitochondrie a chloroplasty Původ mitochondrie – alpha baktérie Původ chloroplastu – cyanobaktérie

Mitochondrie a chloroplasty DNA replikace Nezávislá na buněčném cyklu DNA transkripce RNA polymeráza prokaryotního typu Translace Prokaryotního typu Sensitivita na antibiotika Struktura a kompozice ribozómů N-formyl methionine

Genom mitochondrie Velikost genomu je velice různá Plasmodium falciparum – 6kb Arabidopsis thalianna– 300 Kb Homo sapiens – 16.5 kb

Genom mitochondrie Denzní uspořádání genů Uvolněné používání tRNAs (22 tRNAs místo 30 tRNAs) Variabilní genetický kód Vyšší frekvence mutací (10x) Introny – samo se sestřihující

Genom chloroplastu Velikost 70.000 bp až 200.000 bp Mnohe více genů než u mitochondrie Geny kódující proces transkripce, translace, fotosyntéze, biosyntézy různých malých molekul

Proč si mitochondrie a chloroplasty zachovaly vlastní genomy? Pouze cox1 a cyb jsou přítomné ve všech mt genomech

Polymerázová řetězcová reakce - PCR Umožňuje namnožení DNA z velmi malého množství Kary Mullis – Nobelova cena v roce 1993

Polymerázová řetězcová reakce - PCR KOMPONENTY: PCR primery (12 – 20nt) Taq DNA polymerase (from Thermus aquaticus) dNTPs Pufr (MgCl2) PCR instrument

Polymerázová řetězcová reakce - PCR Cyklus: 90°C – denaturace 50°C – 60°C – nasedání primerů 72°C – elongace 30x

Polymerázová řetězcová reakce - PCR 2. cyklus 3. cyklus

Reverzní transkripce PCR Složitá manipulace s geny obsahující exony mRNA již obsahuje sekvenci, která je translatovatelná Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z retrovirů) vytvoření DNA z mRNA Vytvoření jednoho vlákna cDNA – templátová DNA Studium exprese genů

Directed mutagenesis Umožňuje změnu sekvence Substitute, delece či inzerce aminokyselin Původní plasmidová DNA izolovaná z baktérií je methylována Nová pomocí PCR vytvořená plasmidová DNA není methylována Restrikce za použití enzymu, který štípe pouze methylovanou sekvenci Transformace pouze nově vytvořeného plasmidu