Julius Lukeš , Parazitologický ústav , 2. patro , č. 225 jula@paru . cas cz

Nukleové kyseliny Deoxyribonukleová kyselina (DNA) obsahuje informaci přeložitelnou do aminokyselinové sekvence proteinů Tato informace je uspořádána ve formě jednotek označovaných jako geny Ribonukleová kyselina (RNA) je součástí buněčných mechanismů, které vybírají a spojují aminokyseliny do správné sekvence Centrální dogma zní: DNA  RNA  Protein DNA and RNA jsou polymery nukleotidových jednotek

Ústřední dogma molekulární biologie „Svět RNA“ Ústřední dogma molekulární biologie

Existuje 5 hlavních bazí nukleových kyselin A, G, T, C jsou přítomny v DNA A, G, U, C jsou přítomny v RNA

Všechny nukleotidy mají společnou strukturu

Nukleotidové podjednotky jsou vzájemně spojené fosfodiesterovou vazbou - DNA nukleotid (nt) = fosfat + deoxyribosa (cukr) + base (A,G,C,T) Fig. 30.1

DNA může procházet vratným oddělením vláken

Řada DNA molekul existuje v kruhové formě a její lokální rozvijení může způsobit superspiralizaci supercoiled relaxed

RNA molekuly se vyskytují v řadě konformací

Pro syntézu proteinů a nukleových kyselin platí řada společných pravidel Proteiny a nukleové kyseliny jsou tvořené omezeným počtem různých monomerních stavebních kamenů Monomery jsou přidávány jeden po druhém Každý polypeptid a řetězec nukleové kyseliny má specifický počáteční bod, z něhož pokračuje růst jedním směrem k přesně stanovenému konci Počáteční produkt syntézy bývá často modifikován

Syntéza nukleových kyselin Vlákna DNA i RNA jsou vytvářena kopírováním templátového vlákna DNA Vlákno nukleové kyseliny roste ve směru 5’  3’ RNA polymerázy mohou samy začít syntézu vlákna, zatímco DNA polymerázy vyžadují primer(ové vlákno) Sekven(c)ování a) Syntéza DNA se řídí templátem a vyžaduje primer b) DNA polymeráza postupně přidává deoxynukleotidy ke 3' konci [5'-->3']

Primer se váže do specifické oblasti DNA polymeráza prodlužuje řetězec od 3’ konce primeru 5’ 5’ 3’

Sekvenování (pokrač.) c) dideoxynukleotidy - inhibitory ukončující řetězec d) enzymatické sekvenování: i) používá se směs dATP, dTTP, dGTP, dCTP a ddATP -> část molekul je ukončena na každém A [v případě ostatních tří nukleotidů se přidává ddTT nebo ddCTP nebo ddGTP] ii) produkty sekvenace jsou denaturovány a rozděleny gelovou elektroforézou iii) velikost DNA řetězců odráží pořadí bází

U dNTP může syntéza na 3’ konci pokračovat, zatímco u ddNTP to dideoxyribonukleotidy ukončují syntézu DNA U dNTP může syntéza na 3’ konci pokračovat, zatímco u ddNTP to není možné, protože chybí 3’- OH skupina H di

5’ ddA A 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’

ATGCTTGCCAATT ddATP ddTTP ddGTP ddCTP V souboru nasyntetizovaných molekul je v každé pozici vždy část z nich ukončena

Fig. 16-14

Sekvence z automatického sekvenátoru

Illumina sequencing (Sequence method is not optimized for kDNA...) 23

sequencing by synthesis but each base contains fluorophore and terminator 24

fluorophore removed and 3’ block removed 25

Replikace DNA Replikace DNA je semikonzervativní, tzn. že každá nová molekula obsahuje staré vlákno, které slouží jako templát pro syntézu nového vlákna Je nezbytná asistence řady enzymů Dochází k málo chybám (~1/miliardu nukleotidů)

Proteiny se vyvijejí odlišnou rychlostí Fibrinopeptid 0.7 Hemoglobin 5 Cytochrom c 21 Histon H4 500

Rozdíl mezi semi-konzervativní a hypotetickou konzervativní replikací DNA

Hypotézy o replikaci DNA 1.při buněčném dělení dědí dceřinné buňky kopii genomu 2.konservativní replikace = 1 buňka dostane veškerou mateřskou DNA 3.dispersní replikace = nová a stará DNA jsou namíchány 4.semikonservativní replikace = každá buňka získá jedno nové a jedno staré vlákno Experiment Meselsona a Stahla (1953) 1. densitní centrifugace i) při vysokých centrifugačních silách bude roztok CsCl koncentrovanější směrem ke dnu zkumavky (=vyšší densita) ii) molekuly budou sedimentovat do oblastí odpovídajících jejich densitě iii) DNA vlákna s inkorporovaným 15N budou sedimentovat níže než STEJNÁ vlákna nesoucí 14N

Densitní značení DNA

Densitní centrifugace DNA UV

2. Po kultivaci bakterií v médiu s 15N = těžká DNA byly přesunuty do média s 14N, aby viděli jak se změní densita DNA po replikaci 3. Jedna replikace -> střední densita DNA - tento fakt eliminuje konservativní replikaci

4. Replikace podruhé - intermediátní a lehká densita DNA- tento fakt eliminuje dispersivní replikaci

Replikace DNA začína ve specifických chromosomálních místech zvaných “replication origins” Konsensus sekvence minimálního bakteriálního replikačního počátku (origin) Počátek replikace je v každém organizmu představován (1) jedinečným úsekem DNA s četnými krátkými “repeats”, (2) je rozeznáván multimerními “origin-binding” proteiny a (3) obvykle je A-T bohatý

Replikace DNA Replikační origin: syntéza z něho běží oběma směry, čímž se tvoří bublina od replikační vidlice “replication fork” (= místo elongace DNA) (and DNA helicase)

Existuje řada “problémů”, které musí DNA polymeráza překonat, aby mohla kopírovat DNA DNA polymerázy nedovedou rozvolnit DNA duplex, tak aby oddělily obě vlákna, která mají být kopírována Všechny známé DNA polymerázy dovedou pouze prodlužovat již existující vlákno DNA či RNA (tzv. “primer”) a nedovedou tudíž začít syntézu vlákna Obě vlákna v DNA duplexu mají opačnou chemickou polaritu, ale všechny DNA polymerázy katalyzují přidávání nukleotidů k 3-hydroxylovému konci rostoucího vlákna, které tudíž může růst pouze ve směru 5 k 3

K replikaci je nezbytný primer DNA polymeráza nedovede začít sama replikovat DNA a vyžaduje tudíž, aby původní DNA obsahovala primer Primáza syntetizuje počáteční nukleotidy (RNA primer), na něž se DNA polymeráza váže RNA primer je později nahrazen nukleotidy DNA

Protein DnaA začíná replikaci u Escherichia coli

DnaB je helikáza E. coli, která dovede rozpustit duplex DNA

V replikační vidlici je jedno vlákno syntetizováno diskontinuálně z četných primerů

Vlákna DNA jsou antiparalelní Nová DNA roste z 5’3’, jelikož DNA polymeráza připojuje nukleotidy pouze k 3’ konci vlákna DNA (leading strand) Okazakiho fragmenty, což jsou krátké úseky nově syntetizované DNA (dlouhé tisíce bází u prokaryot a stovky u eukaryot), jsou spojovány DNA ligázou za vzniku “lagging vlákna” DNA

3. Nový fragment lagging strandu je syntetizován Syntéza leading a lagging vláken - pokračování 5’ 3’ lagging strand RNA primers leading strand 5’ 3’ 1. DNA je postupně rozvinována 3’ lagging strand 5’ leading strand RNA primers 3’ 2. leading strand je prodlužován 5’ 3. Nový fragment lagging strandu je syntetizován

Replikace DNA je postupná 3’ 5’ Poznámka: v tomto obrázku nejsou znázorněny RNA primery

Detail ligování fragmentů “lagging” vlákna, po němž se vytváří souvislé vlákno

Replikační vidlice

“Leading” a “lagging” vlákna jsou synthetizována najednou

Koordinace replikace “leading” & “lagging” vláken Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Koordinace replikace “leading” & “lagging” vláken

Souhrn proteinů Vedle primázy, DNA polymerázy a DNA ligázy jsou nezbytné 2 další proteiny Helikáza: zodpovědná za rozplétání DNA Single-strand binding proteiny (SSB): udržují původní komplementární vlákna oddělená

Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

Zásadní věc - chyby! Chybné zařazení nepárujících nukleotidů během syntézy je poměrně běžné a je opravováno samotnou DNA polymerázou mechanismem zvaným “mismatch repair” Mechanismem zvaným “Excision repair” se opravuje poškozená DNA post-replikačně (nesouvisí to s replikací)

Deaminace a depurinace relativně častá deaminace může být důvodem proč není v DNA uracil

Pyrimidinový dimer další relativně častý typ poruchy

Mutace (změny v genetickém materiálu) mohou být: Bodové mutace:chemické změny v pouze jediné nebo několika bázích v genu “Base-pair substitutions”: nahrazení jednoho nukleotidu jiným tiché měnící smysl (missence) nesmyslné (nonsense) “Insertion/Deletion”: změny v počtu nukleotidů Posun čtecího rámce (=Frame shift)

Poškození a oprava DNA a jejich funkce při karcinogenesi Sekvence DNA může být změněna chybami při kopírování způsobenými DNA polymerázou během replikace, nebo látkami z vnějšího prostředí, jakými jsou např. chemické mutageny či radiace Pokud nejsou (rychle) opraveny, mohou tyto změny narušovat přirozenou funkci buňky Porucha DNA může být opravena různými procesy Karcinogeny způsobují změny v sekvenci DNA a poruchy a opravy DNA jsou tudíž důležitými aspekty při vzniku rakoviny Prokaryotické a eukaryotické opravné systémy jsou analogické

Schematický model “proofreading” funkce DNA polymerázy

Funkce topoisomeráz při replikaci DNA Molekuly DNA se v prostoru stáčí a ohýbají, což způsobuje změny topologie, např. “superkoily” Topoisomerázy jsou enzymy, které kontrolují topologii DNA a mají zásadní funkce během řady různých replikačních kroků V E. coli odstraňuje topo I negativní superspiralizaci DNA Topoisomerase II vnáší negativní superspiralizaci do DNA Stupeň superspiralizace DNA je určován protichůdnými aktivitami obou enzymů. Negativní superkoily jsou vnášené prostřednictvím topo II a jsou relaxované topo I

Rozdělení DNA topoisomerů SV40 obsahujících různý počet superkoilů

Topoisomerázy typu II mění topologii DNA tím, že přeštípnou a opět spojí dvouvlákno DNA

Topoisomerázy typu I relaxují DNA tím, že štípnou (“nicking”) a poté opětovně spojí jedno vlákno v duplexu DNA

Model katalytické aktivity topoisomerase II E. coli (DNA gyráza)

Replikované kruhové molekuly DNA jsou odděleny topoisomerázou typu II Lineární dceřinné chromatidy jsou rovněž odděleny topoisomerázou II

Funkcí DNA gyrázy je odstraňovat pozitivní superkoily, které se tvoří před rostoucí replikační vidlicí

Je celá řada proteinů, které se účastní biogeneze DNA a RNA v buňce - DNázy, RNázy (endonukleázy a exonukleázy), restrikční enzymy (štípající s převisem, na tupo; 4katry až n-katry) atd. Budete probírat podrobněji v metodických přednáškách, protože využití vlastností těchto a jiných proteinů stojí de facto za obrovským pokrokem molekulární biologie

Problém: jak uložit tolik DNA do genomu?

DNA-replikace je rozsáhlá záležitost DNA molekuly jsou enormně dlouhé, u člověka se jejich velikost pohybuje od 48.000.000 do 240.000.000 nt human chromosomes

Periodicita nukleozomu

Organizace nukleozomu 1.8 závitů (ca. 140 bp) DNA ovinutých kolem 8 histonů = [H2A + H2B]2 + [H3 + H4]2 Histon H1 (nepatří mezi “core” histony) se na DNA váže v místě vstupu a výstupu DNA z nukleozomu

Struktura nukleosomu [H3 + H4]2 vytváří jádro s jedním heterodimerem [H2A + H2B] nad ním a dalším [H2A + H2B] pod ním

30 nm silné vlákno Mohou být stabilizovány: histonem H1 (váže se ve vstupu a výstupu DNA z nukleozomu) histonovými konci

30 nm silné vlákno vytváří spirálu (solenoid) 6 nukleosomů/otáčku je stabilizováno histonem H1

Nukleosomy jsou komplexy histonů

Úrovně sbalení chromatinu viděné v elektronovém mikroskopu Výsledek: DNA je sbalena do mitotického chromosomu, který je 10-50 000x kratší než celková délka DNA

DNA je kompaktně sbalena díky vazbě proteinů. Nejvyšší strukturou je mitotický chromosom.

Remodelační komplexy jsou komplexy proteinů zpracovávající ATP,které se pohybují po DNA a rozvolňují a vytváří nukleosomy a umožňují vazbu DNA-binding proteinů, např DNA a RNA polymeráz a transkripčních faktorů

Existují 2 typy chromatinu heterochromatin = kompaktní chromatin euchromatin = rozvolněný chromatin

Acetylace histonů aktivuje transkripci (HAT = histone acetyltransferáza)

Modifikace proteinů mění jejich funkci Metylace - připojení CH3 k lysinu Fosforylace - připojení PO4- Acetylace - připojení CH3CO Např. acetylací lysinu nebo fosforylací serinu se mění celkový kladný náboj proteinu

Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

Molekulární definice genu Gen je takový úsek DNA, který je nutný pro syntézu funkčního polypeptidu Oblasti DNA, které kódují molekuly RNA jako tRNA a rRNA také považujeme za geny V eukaryotické DNA leží geny mezi velkými úseky nefunkční, nekódující DNA. Geny mohou rovněž obsahovat oblasti nekódující DNA

Genom vyšších eukaryot obsahuje hodně “nefunkční” DNA U eukaryot nekoreluje velikost genomu s fylogenezí

Obsah DNA je v eukaryotickém genomu velmi variabilní V průběhu evoluce se genom zmenšuje nebo expanduje?

Bakteriální operony vytvářejí polycistronickou mRNAs, zatímco většina eukaryotických mRNAs je monocistronická a obsahuje introny

V eukaryotických genomech se nalézají složité i jednoduché transkripční jednotky

Různé typy eukaryotické DNA nejsou nikdy přepisované

Mobilní DNA Mobilní sekvence (částečně opakované) se vyskytují v prokaryotických genomech, u vyšších rostlin a živočichů Tyto sekvence jsou dlouhé od stovek do tisíců bází Tyto sekvence jsou kopírované a integrované (=vkládané) do nových oblastí v genomu procesem transpozice Pro mobilní sekvence není známa žádná užitečná funkce

Mobilní elementy se mohou pohybovat ve formě DNA či RNA

Obecná struktura bacteriálního transposonu

Mobilní elementy mají patrně velký význam během evoluce Inzerce mobilního elementu do nebo poblíž transkripční jednotky může způsobit spontánní mutace Homologní rekombinace mezi mobilním DNA elementem může přispět ke genové duplikaci a jiným přestavbám, včetně duplikace intronů, rekombinace intronů s následnou tvorbou nových genů a změnami kontroly genové exprese

Funkční přestavby chromosomální DNA Zatímco se zdá, že transposice mobilního elementu nemá žádný okamžitý vliv na organismus, různé typy přestavby DNA jsou pro něj výhodné a důležité Příkladem jsou inverze a delece úseků DNA a jejich amplifikace Tyto funkční přestavby probíhají u prokaryot i eukaryot

Organizace buněčné DNA do chromosomů Většinou jsou bakteriální chromosomy kruhové s pouze jedním počátkem replikace Každý eukaryotický chromosom je tvořen jednou lineární molekulou DNA, která obsahuje několik počátků replikace (=origins of replication) Eukaryotická DNA je asocióvaná s histony, čímž se vytváří chromatin Mikroskopická pozorování počtu a velikosti eukaryotických chromosomů a způsob jejich barvení odhalily řadu důležitých aspektů jejich struktury

Barvené chromosomy mají charakteristické proužkování

Počet chromosomů a jejich velikost a tvar během metafáze jsou druhově specifické

Jednotlivé chromosomy mají v jádře přesné místo

Pro replikaci a dědění eukaryotického chromosomu jsou nezbytné 3 funkční elementy počátky replikace DNA centromera 2 konce (telomery)

Centromery jsou nezbytné pro stabilitu chromosomů během mitózy jsou strukturně složité DNA v lidských centromerách je představována rodinou vysoce repetitivní, tandemově uspořádané ‘satelitní’ DNA, která měří na délku 300-5,000 kb

Jak fungují centromery? Jsou místem tvorby kinetochorů, které umožňují přichycení sesterských chromatid k mikrotubulům, vybíhajícím z pólů dělícího vřeténka kinetochor je velký proteinový komplex, který zprostředkovává vazbu mezi vřeténkem a chromosomy

Konce DNA molekul - telomery: umožňují úplnou replikaci chromosomálních konců chrání chromosomy před zkracováním a spojováním s jinými molekulami DNA.

Telomery (pokračování) Všechny lidské metafázové chromosomy hybridizují s telomerickou repetitivní sekvencí (TTAGG)n

Telomery (pokračování) DNA polymeráza nedovede syntetizovat úplné konce DNA molekuly Postupné zkracování po každé replikaci by mělo za následek ztrátu důležité informace Telomeráza dosyntetizovává mnoho kopií sekvence TTAGGG na konce DNA molekul (=telomery) Telomeráza se obvykle nachází pouze v zárodečných a pohlavních buňkách Její přítomnost v rakovinných buňkách může vést ke vzniku nádorů

Jak se telomery vytvářejí? Telomeráza je komplex proteinu s RNA, který má reverzně transkripční aktivitu

Telomeráza si tudíž ve formě RNA sebou nosí svůj templát

Telomeráza (pokrač.)

Organelární DNA Mitochondrie obsahují jednu, ale většinou více molekul mtDNA Geny mtDNA vykazují cytoplasmatickou dědičnost a kódují rRNAs, tRNAs, a několik mitochondriálních proteinů Velikost a kódovací kapacita mtDNA je u jednotlivých organismů velmi odlišná Produkty mitochondriálních genů nejsou exportovány Mutace v mtDNA způsobují u lidí závažné genetické choroby Chloroplasty obsahují velkou kruhovou DNA kodující více než 100 proteins Apikoplast a jiné organely u prvoků mají svojí vlastní DNA

Lidská mtDNA

Mitochondriální genetické kódy se odlišují od standartního genetického kódu

Obecný postup klonování s plasmidovými vektory

Klonování pomocí plasmidů umožňuje isolaci cílových molekul DNA z směsných roztoků

LABORATORY OF MOLECULAR BIOLOGY OF PROTISTS Kontakt: Julius Lukeš - jula@paru.cas.cz 38-777-5416 Nabídka bakalářské práce v naší laborce (nástup v listopadu 2006) Zapojení v těchto projektech: Functional analysis by RNA interference of accessory factors in RNA editing           Functional analysis by RNA interference of Fe-S cluster biosynthesis pathway Complementational analysis of putative mitochondrial proteins in various protozoans                                                                                                                                                                                                                                                                                                            

Cytoplasmatická dědičnost mutantních mitochondrií