Separační metody

Optické a separační metody Obsah přednášky Chromatografie Plynová Kapalinová Další Elektromigrační metody Hmotnostní spektrometrie

Separační metody Separace – dělení Vzorek - směs více látek Získání minimálně 2 podílů o rozdílném složení Filtrace, krystalizace, centrifugace, destilace Chromatografie, elektromigrační metody, MS

Separační metody Dělení podle principu Fázové rovnováhy Rozdíly v rovnovážné distribuci složek mezi 2 fáze (g)-(l): destilace, plynová chromatografie (GC) (g)-(s): sublimace, GC, molekulová síta (l)-(l): extrakce, kapalinová chromatografie (LC) (l)-(s): zonální tavení, frakční krystalizace, LC, molekulová síta Rychlostní procesy Rozdíly v rychlosti pohybu složek Membránové separace: ultrafiltrace, osmóza, (elektro)dialýza Separace polem: elektroforéza, MS

Separační metody Fázové rovnováhy Rozdělení mezi 2 nemísitelné fáze Adsorpce na polárních sorbentech a chemisorpce Zachycování molekul na povrchu tuhé fáze Adsorpční centra – místa záchytu Van der Waalsovy síly - fyzisorpce Chemické reakce – chemisorpce 2 fáze: 1) vytěsnění adsorbovaných molekul mobilní fáze 2) tvorba monomolekulární vrstvy adsorbovaných molekul Adsorpční izotermy: Langmiurova, Freundlichova

Separační metody Fázové rovnováhy Iontová výměna Sorbent, který zachycuje určitý typ iontů, zároveň uvolňuje jiný Anexy Katexy Pevné látky, příp. gely Použití pro ionty kovů Sítový efekt Molekulová síta Sorbent s definovanou velikostí pórů Separace plynů podle velikosti molekul nebo atomů

Chromatografie Chromatus+graphein Historicky – dělení podle barev Michail Cvet – separace rostlinných barviv, kolona s CaCO3 Založeno na distribuci mezi 2 fáze: pevnou (stacionární) a pohyblivou (mobilní) Postupné mnohonásobné opakování rovnovážných stavů

Chromatografie Separační principy Adsorpční chromatografie Stacionární – (s), mobilní – (l)(g) Rozdělovací chromatografie Stacionární – (l), mobilní – (l)(g) Chemisorpční chromatografie Iontově-výměnná chromatografie Gelová permeační chromatografie

Chromatografie Základní dělení Kapalinová chromatografie Mobilní fáze – kapalina Plynová chromatografie Mobilní fáze - plyn

Chromatografie Dynamická teorie chromatograf. procesu Teoretické patro – 1 ustavení rovnováhy HETP – výška ekvivalentní teoretickému patru Van Deemterova rovnice: HETP = A+B/µ + Cµ µ….rychlost průtoku mobilní fáze A…parametr, turbulentní proudění B…parametr, difúze C…parametr, působení proti dufúzi

Chromatografie Plynová Mobilní fáze – plyn (H2, He) Stacionární fáze Sorbent – adsorpční ch. Kapalina – rozdělovací ch. Molekulové síto – ch. na molekulových sítech Dávkování vzorku Plyny Zplyňování roztoku – zplyňovací komůrka zahřívána Injekční port Septum 6 cestný ventil

Chromatografie Plynová Kolona – dělení Kolona i detektor termostatovány – teplotní program Kolony pro GC: Náplňové Stacionární fáze – pevný sorbent Aktivní uhlí, silikagel, polymery, molekulová síta, velký povrch Průměr kolony 2 – 5 mm, délky 1 – 5 m, nerez ocel, sklo Dělení plynů Náplňové pro rozdělovací GC Stacionární fáze – kapalina Uhlovodíky, methylsilikonové oleje Potažená stěna kapiláry, inertní nosiče – křemelina, SiO2

Chromatografie Plynová Kolony pro CG: Kapilární kolony Pro adsorpční GC Tenká vrstva pevného sorbentu na vnitřní stěně kapiláry PLOT – porous layer open tubular Průměr < 1 mm Pro rozdělovací GC Film kapalné stacionární fáze na vnitřní stěně kapiláry WCOT – wall coated open tubular Mnohem menší vnitřní průměr Dávkování vzorků ve velmi malých množstvích Dělení složitých směsí

Chromatografie Plynová Detektory Tepelně vodivostní detektor (TCD) Univerzální, široký rozsah Nízká citlivost, měření odporu Plamenově ionizační detektor (FID) Univerzální, citlivější než TCD Pro organické látky Vzduch-vodíkový plamen Nosné plyny: NH3, CS2, CO, O2, CO2, H2

Chromatografie Plynová Detektory GC Detektor elektronového záchytu (ECD) Jedny z nejčastějších β-zářič (63Ni) Nosný plyn nesmí elektrony zachycovat Organické látky s halogeny, nitroskupinami, bifenyly

Chromatografie Plynová - aplikace Analýzy plynů Analýza snadno zplynitelných látek Spojení GC-MS: pomlčkové metody Oblast životního prostředí Pesticidy Klinická a toxikologická analýza Drogy, léčiva, alkohol Analýza ropných produktů Analýza potravin, kosmetických přípravků

Chromatografie Plynová

Chromatografie Kapalinová Mobilní fáze – kapalina Elektrolyty, rozpouštědla Stacionární fáze – pevná, kapalná Plošné uspořádání – tenkovrstvá, papírová ch. Kolonové uspořádání Tenkovrstvá ch. Silikagel, Al2O3 vrstva na nosiči Papírová ch. Papír – sorbent – uchycování látek Speciální papíry Sestupné/vzestupné uspořádání Použití pro kvalitu ne kvantitu Uzavřená nádoba – zabránění odpařování rozpouštědla Retardační faktor Rf = b/a a…start-čelo; b…start-skvrna Identifikace aminokyselin, přírodní barviva

Chromatografie Kapalinová Kolonové uspořádání HPLC, UHPLC – vysoká účinnost Instrumentace Vysokotlaké čerpadlo Dávkovací ventil – vícecestný, dávkovací smyčky Kolona – může a nemusí být termostatovaná Kolony mnohem kratší než u GC Detekce

Chromatografie Kapalinová Kolony Silikagel, Al2O3, aktivní uhlí Polymerní sorbenty Ionexy Hydrofobní gely Methakrylátové kopolymery Detektory Univerzální detektory – změna fyzikálně chemických vlastností – refraktometrie, vodivost ad. Selektivní – UV-VIS, voltametrie, MS

Chromatografie Kapalinová - aplikace Převážně HPLC Separace a stanovení peptidů, aminokyselin, organických kyselin Léčiva, barviva, pesticidy, PAU Fenolické látky Klinická biochemie, potravinářství Kontrola ŽP Farmakologické studie

Chromatografie Kapalinová

Další typy chromatografií Iontová chromatografie Podobná HPLC Dělení polárních látek, iontů Stacionární fáze – iontoměnič Mobilní fáze – vodný roztok iontů Užití elektrochemických detekčních metod Vzorky podobné elektromigračním metodám Size exclusion chromatografie Rozdělování na základě velikosti molekul Stacionární fáze – pórovité látky (molekulová síta) Instrumentace podobná HLPC Nedosahuje účinnosti HPLC

Elektromigrační metody Princip: rozdíl v rychlosti migrace nabitých částic v elektrickém poli Základní uspořádání Katodový prostor – separační prostor – anodový prostor Kapilární zónová elektroforéza Kapilární izotachoforéza

Kapilární zónová elektroforéza Stejný základní (nosný) elektrolyt v celém systému Vysoké napětí (30 – 60 kV) Směs iontů (kationty a anionty) se rozdělují v pořadí daném různou rychlostí migrace – vytváření zón Instrumentace: Křemenné kapiláry Dávkování – mikro – nanolitry Detekce: UV-VIS, flourometrická, vodivostní, MS Výstupní signál – elektroforegram – v závislosti na čase Výška/plocha – úměrná množství Plocha podle času - kvalita

Elektroforéza

Kapilární izotachoforéza Kapiláry 2 elektrolyty Vedoucí L – nejvyšší pohyblivost Zakončující T – nejnižší pohyblivost Látky se dělí do zón pohybujících se stejnou rychlostí Rozdělování jen látek, které jsou stejně nabité Detekce stejná jako u elektroforézy

Izotachoforéza

Elektromigrační metody Aplikace Laboratoře klinické biochemie Potravinářství, zemědělství Léčiva ŽP Aminokyseliny, mastné organické kyseliny Anorganické anionty a kationty Fenolické látky Vitamíny Pesticidy

Hmotnostní spektroskopie - MS Nejedná se o optickou metodu Dělící metoda Dělení podle hmotnosti a náboje I = f(m/z) Princip: Ionizace látky – přidání velkého množství energie Urychlení iontů v elektrickém poli Separace v magnetickém poli (m/z)

Hmotnostní spektroskopie – MS Hmotnostní spektrum Čárové spektrum Závislost iontového proudu dopadajícího na detektor na poměru m/z Aplikace: Organická analýza Detekce a identifikace látek ve stopovém množství GC-MS, HPLC-MS

Hmotnostní spektrometrie Dělení iontů Magnetické pole Kvadrupólový detektor TOF Orbitrap Iontová past

Hmotnostní spektrometrie Typy ionizace Vakuové ionizace Elektronová Těkavé látky Chemická Reagenční plyn MALDI (Matrix-assisted laser desorption ionization) Analyt v pevné organické matrici Laser

Hmotnostní spektrometrie Typy ionizace Atmosférické ionizace Termická ionizace Ar plasma Spray ionizace Často v kombinaci s HPLC ESI – electrospray ionization APCI – atmospheric pressure chemical ionization Fotoionizace

Hmotnostní spektroskopie - MS

Pro dnešek vše 