Seminář pro maturanty z biologie 2007 Genomika Seminář pro maturanty z biologie 2007

Ilustrace k článku Francise Collinse z roku 2003, kdy byla dokončena kompletní sekvence lidského genomu (VIZ i následující obr.)

Genové inženýrství užitečné termíny Rekombinantní DNA = DNA, ve které se nachází geny nejméně ze dvou zdrojů, často ze dvou různých druhů organismů Biotechnologie = manipulace s organismy nebo jejich součástmi za vzniku užitečného produktu Plasmid = malá kruhová DNA, nacházející se v bakteriích. Plasmid není součástí bakteriálního chromosomu Vektor = molekula DNA, která je schopna dopravit cizí DNA do buňky a replikovat ji zde. Vektorem může být plasmid

Klonování DNA

Klonování DNA Isolace plasmidu z baktérie a isolace genu, který nás zajímá z genomu člověka Vložení genu do plasmidu Vrácení plasmidu do bakterie Z každým rozdělením bakterie dojde rovněž k replikaci plasmidu a tím i genu Využití: buď za účelem genového produktu (insulin, růstový hormon), nebo za účelem namnožení samotného genu

Restrikční enzymy V přírodě tyto enzymy chrání bakterie proti cizorodé DNA, pronikající do buňky, typicky proti virové DNA Umí štěpit DNA, = provádět její restrikci Štěpí DNA na určitých, specifických místech, o délce obvykle 4 – 8 nukleotidů, často symetrických, např. GAATTC (= enzym EcoR1). Protože se toto místo nachází náhodně na mnoha místech cizí DNA, proběhne v nich štěpení Vlastní bakteriální DNA je na restrikčních místech chráněna proti štěpení přidáním metylové skupiny na adeniny a cytosiny

Restrikční enzymy V přírodě restriktázy umí štěpit „nepřátelskou“ DNA bakteriofágů

Restrikční endonukleázy EcoR1

Restrikční enzymy Protože dochází ke štěpení pouze v konkrétních restrikčních místech, i mnoho kopií stejné DNA poskytne tytéž restrikční fragmenty Restrikční fragmenty jsou štěpeny tak, že vzniknou tzv. kohezní konce (sticky ends) (VIZ další obrázek)

Restrikční enzymy Kohezní konce (sticky ends) Kohezní konce budou tvořit vodíkové vazby s jinými restrikčními fragmenty, vzniklými působením téhož restrikčního enzymu Enzym DNA ligáza (nám známý z kapitoly o replikaci DNA) vytvoří fosfodiesterové kovalentní vazby

Klonování genů do plasmidů

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu Isolace vektoru a genu, o který máme zájem V našem případě pochází plasmid z E. coli a obsahuje Gen ampR zajišťující resistenci proti antibiotiku ampicilínu Gen lacZ, kódující enzym β-galaktozidázu, která katalyzuje štěpení cukru laktózy Jediné restrikční místo dané restriktázy, které se nachází uvnitř genu lacZ

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 2. Inserce DNA do vektoru Plasmid i lidskou DNA naštěpíme restriktázou: enzym rozštěpí plasmid na jediném místě – v lacZ genu a lidskou DNA na mnoha tisících místech. Jeden restrikční fragment z nich bude obsahovat i náš gen

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 2. Inserce DNA do vektoru Vznikne pochopitelně mnoho útvarů: dva plasmidy slepené k sobě, plasmid s několika kusy DNA, re-formovaný plasmid atd. Díky náhodě ale vznikne i plasmid obsahující gen našeho zájmu, jak ukazuje obrázek

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 3. Vrácení vektoru do bakterie Tzv. transformací (zisk nahé DNA z okolního prostředí) se plasmidy vrátí do bakterie Tyto bakterie jsou předem upraveny tak, že mají lacZ- mutaci = neumí hydrolyzovat laktózu

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 4. Klonování bakteriálních buněk (…a plasmidů v nich) Bakterie jsou vloženy na živné médium obsahující ampicilin a cukr zvaný X-gal. Každá reprodukující se bakterie nakonec vytvoří kolonii viditelnou pouhým okem

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 4. Klonování bakteriálních buněk (…a plasmidů v nich) Vyrostlé kolonie budou určitě obsahovat plasmid, neboť v médiu je antibiotikum ampicilin, které ostatné bakterie zahubí Cukr X-gal je hydrolyzován β-galaktosidázou za vzniku modře zbarvených bakteriálních kolonií Pokud ale baktérie nemá funkční gen lacZ, kolonie budou bíle zbarvené – ty nás zajímají

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 4. Klonování bakteriálních buněk (…a plasmidů v nich) Tímto způsobem ovšem získáme kolonie bakterií, obsahujících mnoho a mnoho různých fragmentů lidské DNA, nejen ten, o který nám jde Následuje nejtěžší krok: rozeznat kolonii bakterií, která obsahuje v plasmidu gen našeho zájmu

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 5. Identifikace klonu nesoucí gen našeho zájmu Můžeme hledat buď gen sám nebo jeho proteinový produkt Pokud víme, jakou sekvenci gen obsahuje, použijeme metodu hybridizování nukleových kyselin (nucleic acid hybridization)… …za užití krátké jednovláknové DNA, která je komplementární ke známé sekvenci genu. Tato DNA se nazývá nucleic acid probe, česky poněkud slangově zvaná „próba“

Klonování genů do plasmidů

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 5. Identifikace klonu nesoucí gen našeho zájmu Próbu označíme radioaktivním isotopem nebo fluorescenčním barvivem

Identifikace klonovaného genu Důležitým krokem je denaturace bakteriální DNA. Provádí se buď teplem, nebo chemicky. Při následné renaturaci se próba naváže ke hledanému genu, je-li přítomen

Klonování eukaryotického genu do bakteriálního plasmidu 5. Identifikace klonu nesoucí gen našeho zájmu Pokud buňky překládají hledaný gen do proteinu, můžeme detekovat přímo protein A to buď specifickými protilátkami Nebo za pomoci jeho enzymatické aktivity

Klonování a exprese eukaryotických genů Klonovaným genům chybí bakteriální promotor Bakteriální geny nemají introny – a bakterie tedy postrádají aparát schopný sestřihu. Tomuto problému čelíme vytvořením tzv. cDNA Mnoho eukaryotických proteinů funguje až po posttranslačních úpravách – přidání sacharidové složky atd.

cDNA Nejprve potřebujeme získat z eukaryotické buňky již hotovou, sestřiženou mRNA Tuto mRNA isolujeme a za pomocí reverzní transkriptázy vytvoříme komplementární vlákno DNA a v následujcícím kole replikace dvoušroubovici DNA Tato DNA je zvána komplementární DNA, neboli cDNA

cDNA

YAC Problému prokaryotické-eukaryotické nekompatibility se můžeme zbavit užitím kvasinek Kvasinky rostou stejně rychle jako bakterie a mají plasmidy (což je u eukaryot vzácnost) YAC je dalším pokusem – jedná se o umělý kvasinkový chromosom (Yeast Artificial Chromosome): má místa ori, centromeru a telomery Při mitóze se chová jako „divoký“ chromosom Vejde se do ně mnohem více DNA než do plasmidu

Genové knihovny Klonované geny mohou být uchovány v genových knihovnách Genová knihovna = tisíce bakterií obsahující plasmid s jedním určitým genem Krom plasmidových knihoven existují i fágové knihovny

Genové knihovny Klonované geny mohou být uchovány v genových knihovnách

PCR

Polymerase chain reaction PCR

PCR Je technika, která umožňuje v krátkém času namnožit daný kus DNA bez pomoci buněk užívá se, pokud je DNA velmi malé množství nebo je DNA znečištěna za několik hodin je schopna metoda PCR vyprodukovat kolem miliardy kopií DNA

PCR Metoda PCR se sestává ze tří kroků, při kterých se množství DNA zvětšuje exponenciálně klíčovým enzymem je DNA-polymeráza z Thermus aquaticus, žijícím v horkých pramenech Yellowstonského národního parku tato polymeráza nese název Taq polymeráza, je odolná vůči vysokým teplotám a zůstává aktivní přes mnoho cyklů

PCR Krom vysoké rychlosti je na metodě PCR impozantní její selektivita. Známe-li příslušné sekvence, PCR je schopna „vybrat“ z dlouhé molekuly DNA oblast, která má být namnožena, například konkrétní gen objevil Kally Muris 1983. O 10 let později obdržel Nobelovu cenu. Metoda se dnes běžně užívá v mnoha laboratořích

PCR Příklady úspěšného užití: namnožení DNA z 40 000 let starého srstnatého mamuta namnožení mtDNA neandrtálce namnožení nepatrného množství DNA z dějiště zločinu. Stačí malé množství krve, tkáně či spermatu namnožení DNA z jednotlivých embryonálních buněk v rámci prenatální diagnostiky namnožení virové DNA z buněk, ve kterých se dá jinak jen těžko prokázat přítomnost viru, jako je HIV

PCR Potřeby: DNA, která má být namnožena Taq polymeráza zásoba primerů, ohraničujících cílovou sekvenci. zásoba dATP, dCTP, dGTP, dTTP MgCl2

PCR Prvním krokem je krátké zahřátí celé směsi na 94oC -96oC. Teplem se poruší vodíkové vazby a oba řetězce DNA se oddělí

PCR Druhým krokem je ochlazení směsi na 50oC - 65oC. Ochlazení umožní primerům se navázat na cílovou DNA vodíkovými můstky podle pravidel komplementarity

PCR Primery jsou krátké, synteticky vyrobené molekuly jednořetězcové DNA (20-30 nukleotidů), které jsou komplementární ke koncům DNA, která má být amplifikována. Primery tak determinují místo na DNA, které má být zmnoženo (na obrázku označeno modře)

PCR Třetí krok: DNA-polymeráza nyní může přidávat nukleotidy k 3´koncům primerů, jako při obvyklé replikaci Směs je zahřáta na 72oC

PCR Směs je nyní znovu ohřáta a začíná nové kolo cyklu každé kolo trvá pouze asi 5 minut. Výsledkem je dvojnásobné množství cílové DNA, dlouhé i stovky párů bází tento tříkrokový cyklus je následně opakován znovu a znovu. Za třicet cyklů je možno teoreticky obdržet miliardu kopií

PCR

PCR

Gelová elektroforéza Gelová elektroforéza je metoda, která odděluje jednotlivé fragmenty DNA na základě jejich pohybu gelem. Pohyb je způsoben elektrickým polem směr a rychlost pohybu je dán nábojem molekul, jejich velikostí a tvarem a rovněž velikostí náboje elektrického pole a složením gelu DNA je nabitá záporně, bude se tedy pohybovat ke kladnému konci

Gelová elektroforéza

Gelová elektroforéza

Gelová elektroforéza

Analýza DNA a genomika

Genomika Jak již jednou máme gen, který nás zajímá v knihovně, je možno začít klást otázky Liší se sekvence tohoto genu u lidí zdravých a nemocných nějakou konkrétní chorobou? Na kterém chromosomu se gen nachází a ve kterých buňkách a kdy je exprimován? Liší se tento gen od genů jiných druhů, vykonávající stejnou funkci? A jak mnoho?

Genomika Nakonec chceme poznat kompletní sekvenci tohoto genu a rozdíly v sekvenci mezi zdravými a a nemocnými Přesné rozdíly mezi sekvencí tohoto genu a genů jiných druhů organismů Chceme rovněž poznat kompletní sekvenci celého organismu

Elektroforéza restrikčních fragmentů

Elektroforéza restrikčních fragmentů Každou ze zkoumaných DNA, např. dvě alely téhož genu, natrávíme stejnou restriktázou Pokud se sekvence písmen liší, budou se lišit i restrikční místa a tedy i počet a délka vzniklých fragmentů

Southernův přenos

Southernův přenos Southern blotting Výhodou je, že začneme s DNA z celého genomu – vyhneme se tak zdlouhavému vytváření knihoven našem modelovém případě byla užita DNA tří jedinců Metoda určí nejen, zda je určitá DNA sekvence přítomna v genomu, ale také v kterém konkrétním fragmentu

RFLP Southernův přenos umožňuje mapovat nejen geny, ale i nekódující úseky DNA Zjistilo se, že v nekódujících úsecích DNA existuje značná variabilita mezi jedinci nebo mezi jednotlivými homologickými chromosomy Tyto rozdíly dostaly název RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) – polymorfismus délky restrikčních fragmentů Jako výchozí materiál může být užit celý genom

RFLP Z minulého obrázku bylo patrné, že jedinci I a II jsou nositeli stejného markeru (=RFLP nebo genu) a že jedinec III je odlišný RFLP se dědí klasickou mendelovskou dědičností Protože RFLPs je po genomu rozeseto mnoho a platí stejná pravidla jako při konstrukci genetické mapy (čím méně crossing-overů mezi RFLP a alelou, tím jsou si blíž), staly se RFLPs užitečnou pomůckou při konstrukci map

Na tento seminář logicky navazuje seminář Projekt lidského genomu