Gene expression microarray Halaška,M., Chod,J., Strnad,P., Kolařík,D., Hrouda,M. Gynekologicko-porodnická klinika FN Motol a 2. LF UK Gynekologicko-porodnická klinika FN Bulovka a 1. LF UK

Úvod známa sekvence lidského genomu: genů známa sekvence lidského genomu: genů metodika analýzy microarray vyvinuta na Stanfordu metodika analýzy microarray vyvinuta na Stanfordu (Schena,M., Science, 270, 1995) na 65 vzorcích testováno 8102 genů na 65 vzorcích testováno 8102 genů (Perou CM, Nature, 2000) clinical implications clinical implications (Sorlie, T, 2001)

Rozdělení podle typu sondy podle typu sondy cDNA cDNA k analýze genomu (sekvenční analýza, variabilita genu) k analýze genomu (sekvenční analýza, variabilita genu) k analýze genové exprese (RNA) k analýze genové exprese (RNA) proteinové proteinové tkáňové (TMAs) tkáňové (TMAs) podle přípravy podle přípravy oligonukleotidy ( bp)pomocí fotolithografie oligonukleotidy ( bp)pomocí fotolithografie cDNA ( bp)předem připravené na čipu PCR cDNA ( bp)předem připravené na čipu PCR

DENATURACE dvouřetězcová DNA jednořetězcová DNA RENATURACE Hybridizace

Hybridizace spojení 2 jednořetězcových molekul (DNA nebo RNA) různého původu DENATURACE RENATURACE

Hybridizace DENATURACE RENATURACE

Postup izolace mRNA z tkáně izolace mRNA z tkáně reverzní transkripcí do DNA - následně namnožení reverzní transkripcí do DNA - následně namnožení označení červenou flurescencí označení červenou flurescencí smíchání se zelenými referenčními geny smíchání se zelenými referenčními geny scanování a vyhodnocení převahy scanování a vyhodnocení převahy

sklo se spec. upraveným povrchem nebo nylonová membrána nanesení:ink jet technology photolitography SONDA cDNA jedno políčko mikročipu = hybridizační jednotka

DNA RNA mRNA cDNA cRNA NK označená fluorescenční barvou

Laserové světlo

DETEKTOR

Měření intenzity fluorescence = odpovídá množství RNA ve vzorku

Microarrays po hybridizaci - počítačové zobrazení Affymetrix - genové čipy cDNA microarray

Hodnocení kontrolované (supervised) kontrolované (supervised) nejdříve stanovení genové exprese nejdříve stanovení genové exprese vytvoření skupin podle podobnosti vytvoření skupin podle podobnostiexprese vytvoření dendrogramu vytvoření dendrogramu poté hledání klinického významu skupin poté hledání klinického významu skupin nekontrolované (unsupervised) nekontrolované (unsupervised) nejčastěji hierarchial clustering nejčastěji hierarchial clustering rozdělení vzorků do skupin podle vlastností rozdělení vzorků do skupin podle vlastností stanovení exprese stanovení exprese hledání genů, které jsou odlišné hledání genů, které jsou odlišné v jednotlivých skupinách

Analýza velkého počtu genů vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese) (70) Extrémní finanční nároky 1 čip USD desítky vzorků

Analýza velkého počtu genů vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese) (70) Extrémní finanční nároky 1 čip USD desítky vzorků Levnější metody kvantitativní RT-PCR miniarrays - čip s omezeným počtem sond

Analýza velkého počtu genů vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese) (70) Extrémní finanční nároky 1 čip USD desítky vzorků Levnější metody kvantitativní RT-PCR miniarrays - čip s omezeným počtem sond Budoucnost: kombinace výsledků do jednoho superčipu - staging, grading, prognóza, rezistence...

Perou,CM., Nature, 2000 soubor 65 vzorků genů, z toho 36 duktálních IBC, 2 lobulárních IBC, 1 DCIS, 1 fibroadenom, 3 normální vzorky soubor 65 vzorků genů, z toho 36 duktálních IBC, 2 lobulárních IBC, 1 DCIS, 1 fibroadenom, 3 normální vzorky u 20 pacientů byla podána chemoterapie, 2 nádory porovnány s SLN u 20 pacientů byla podána chemoterapie, 2 nádory porovnány s SLN referenční cDNA z 11 linií, provedeno hierarchial clustering referenční cDNA z 11 linií, provedeno hierarchial clustering vytipováno 1753 genů, alespoň 4x variabilnější než medián ostatních vytipováno 1753 genů, alespoň 4x variabilnější než medián ostatních nalezena výrazná heterogenita mezi nádory nalezena výrazná heterogenita mezi nádory sety genů byly navzájem nezávislé sety genů byly navzájem nezávislé 15 z 20 vzorků před a po chemoterapii byly velmi podobné (clustred together), stejně jako 2 vzorky metastáz 15 z 20 vzorků před a po chemoterapii byly velmi podobné (clustred together), stejně jako 2 vzorky metastáz byla určena skupina genů – intrinsic gene set – která představovala skupinu výrazně proměnlivých genů mezi jednotlivými nádory byla určena skupina genů – intrinsic gene set – která představovala skupinu výrazně proměnlivých genů mezi jednotlivými nádory vyselektováno 496 genů, pomocí kterých rozdělení na 4 skupiny podle fenotypu: basal-like, luminal-like, ERBB2, normální vyselektováno 496 genů, pomocí kterých rozdělení na 4 skupiny podle fenotypu: basal-like, luminal-like, ERBB2, normální

Sorlie,T., PNAS, 2001 soubor 78 vzorků, 51 vzorků bylo od pacientů po chemoterapii – doxorubicin, následován tamoxifenem, u 2 tumorů testovány rovněž metastázy z lymfatických uzlin soubor 78 vzorků, 51 vzorků bylo od pacientů po chemoterapii – doxorubicin, následován tamoxifenem, u 2 tumorů testovány rovněž metastázy z lymfatických uzlin 427 intrinsic genů na základě předchozí práce 427 intrinsic genů na základě předchozí práce byly nalezeno 6 typů genetických profilů: byly nalezeno 6 typů genetických profilů: gene exp. nameERprognozaBRCAp53 (%) luminal like A++dobráBRCA 213 luminal like B+ 40 luminal like C+ 80 basal like-špatnáBRCA 182 ERBB2+-špatná 71 normální 33

Sorlie,T., PNAS, 2001 (cont.) hodnocení p53:exprese p53 je nezávislá na ERBB2 hodnocení p53:exprese p53 je nezávislá na ERBB2 vytipováno 158 genů v souvislosti s p53 sledována survival analysis, vyselektováno 264 survival genů: sledována survival analysis, vyselektováno 264 survival genů: 71 z 78 nádorů se z hlediska přežití rozdělilo na stejné skupiny jako podle charakteristik (viz výše) zdá se, že skupina luminal like B nebude profitovat z adjuvantní antihormonální léčby (charakteristiky jsou podobné basal like, ERBB2) zdá se, že skupina luminal like B nebude profitovat z adjuvantní antihormonální léčby (charakteristiky jsou podobné basal like, ERBB2)

van´t Veer, PNAS, tumorů (z toho 20 familiárních tu) u mladých žen 117 tumorů (z toho 20 familiárních tu) u mladých žen rozlišeno luminal like A, luminal like B, basal like, ERBB2 rozlišeno luminal like A, luminal like B, basal like, ERBB2 Kaplan-Meier analysis Kaplan-Meier analysis rozdíly mezi luminal A a B nebyly tak zřetelné rozdíly mezi luminal A a B nebyly tak zřetelné 18 BRCA 1 a 2 BRCA 2 18 BRCA 1 a 2 BRCA 2 BRCA 1 nalezeno výhradně v souvislosti s basal like (zároveň vysoká exprese p53, ER negativní, ERBB2 negativní) BRCA 1 nalezeno výhradně v souvislosti s basal like (zároveň vysoká exprese p53, ER negativní, ERBB2 negativní)

You,F., San Antonio, 2004, 1022: pomocí gene expression na 21 vzorcích byla stanovena skupina genů, které by mohly předvídat odpověď na Herceptine/Vinorelbine chemoterapii u HER 2 3+ early breast cancer You,F., San Antonio, 2004, 1022: pomocí gene expression na 21 vzorcích byla stanovena skupina genů, které by mohly předvídat odpověď na Herceptine/Vinorelbine chemoterapii u HER 2 3+ early breast cancer Liu,MC., San Antonio, 2004, 1030: gene expression u linie MDA MB 231 sériově po aplikaci docetaxelu 0-14 dní, identifikován set 122 genů, který s přesností 89 % diskriminoval mezi respondenty a nonrespondenty Liu,MC., San Antonio, 2004, 1030: gene expression u linie MDA MB 231 sériově po aplikaci docetaxelu 0-14 dní, identifikován set 122 genů, který s přesností 89 % diskriminoval mezi respondenty a nonrespondenty Rouzier,R., San Antonio, 2004, 201: FNA u 83 pacientů před neoadjuvantní chemoterapií, použití intrinsic gene set podle Perou, chemoterapie: paclitaxel, 5-FU, doxorubicin, cyklofosfamid, basal-like nejlépe zareagovaly na chemoterapii (cPR), luminal-like nejméně Rouzier,R., San Antonio, 2004, 201: FNA u 83 pacientů před neoadjuvantní chemoterapií, použití intrinsic gene set podle Perou, chemoterapie: paclitaxel, 5-FU, doxorubicin, cyklofosfamid, basal-like nejlépe zareagovaly na chemoterapii (cPR), luminal-like nejméně Miller,WR., San Antonio, 2004, 1020: u 69 pacientů provedeny 3 biopsie během neoadjuvantního podávání letrozolu, vytipování genů a sledování jejich exprese, které souvisí se vznikem rezistence na terapii Miller,WR., San Antonio, 2004, 1020: u 69 pacientů provedeny 3 biopsie během neoadjuvantního podávání letrozolu, vytipování genů a sledování jejich exprese, které souvisí se vznikem rezistence na terapii geny: trefoil, LIV-1, PgR, cyclin B2, BRCA 1 a další Harris,C., San Antonio, 2004, 3007: vytipování 16 genů, které s přesností 89 % mohou předpovídat riziko rekurence nádoru Harris,C., San Antonio, 2004, 3007: vytipování 16 genů, které s přesností 89 % mohou předpovídat riziko rekurence nádoru San Antonio 2004: 87 prezentací

Využití staging, grading, vyhledávání podskupin staging, grading, vyhledávání podskupin therapy tailoring (individualizace léčby) therapy tailoring (individualizace léčby) indikace adjuvantní/neoadjuvantní terapie indikace adjuvantní/neoadjuvantní terapie pochopení metastazování pochopení metastazování genový profil metastáz je velmi podobný primárnímu nádoru (neplatí teorie o selekci) genový profil metastáz je velmi podobný primárnímu nádoru (neplatí teorie o selekci) vytipování genů s významným efektem - cíl terapie vytipování genů s významným efektem - cíl terapie

Projekt Chemosense grant EU: grant EU: Use of in-vitro chemosensitivity testing and gene expression profiling to optimize neo-adjuvant breast cancer treatment (Univ. Prof. Dr. Ch. Singer) cílem: cílem: vyhodnotit možnosti in-vitro testování chemosenzitivity pomocí ATP-TCA u pacientek podstupující neoadjuvantní chemoterapii Epirubicin, Docetaxel vyhodnotit možnosti in-vitro testování chemosenzitivity pomocí ATP-TCA u pacientek podstupující neoadjuvantní chemoterapii Epirubicin, Docetaxel nalezení typické genové exprese, která by předvídala senzitivitu k této chemoterapii nalezení typické genové exprese, která by předvídala senzitivitu k této chemoterapii rozšíření testování na další zhoubné nádory (ca ovaria). rozšíření testování na další zhoubné nádory (ca ovaria).