Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací Barbora Branská Vysoká škola chemicko technologická v Praze Ústav kvasné chemie a bioinženýrství

Mikroorganismy a průtoková cytometrie Konstrukce cytometrů Velikost – (detekce částic, intenzita odezvy, rel. fluorescenční odezva) Tvar buněk Minimum informací x rozmanitost mikroorganismů

Mikroorganismy Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris produkční systém pro syntézu rekombinatních proteinů, indukovatelný silný promotor AOX Thermus sp., T. ruber, T. aquaticus biodegradační schopnosti, syntéza termostabilních enzymů

Hlavní body z biotechnologického pohledu Morfologické znaky Viabilita Enzymová aktivita Obsah intracelulárních složek Růstová dynamika Fyziologické změny

Morfologie Cytometrie Mikroskopie + analýza obrazu Velikost - FSC, EV Tvar - SSC Mikroskopie + analýza obrazu Velikost - plošný obsah Tvar – šířka, délka, cirkularita,…

Morfologie cytometr x mikroskop

Fluorescenční značení - viabilita Membránová integrita Propidium jodid, ethidium bromid, Sytox green Transmembránový potenciál Rhodamin123, DiOC2(3), bis-oxonol Enzymová aktivita Fluorescein diacetát, karboxyfluorescein diacetát

Integrita buněčných membrán Propidium jodid náboj +2 neproniká do prokaryotních ani eukaryotních buněk s intaktní membránou červená fluorescence, 20 x vyšší po vazbě na NK Ethidium bromid náboj +1 pomalu proniká buněčnými membránami Sytox green z živých buněk plně vylučován zelená fluorescence, 1000 x vyšší po vazbě na NK

Membránová integrita PI EB Sytox Směs vitálních a fixovaných b. S. cerevisiae PI EB Sytox

Transmembránový potenciál Rhodamin 123 Kladný náboj Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu Zelená i červená fluorescence DiOC2(3) Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu – změna intenzity červené fluorescence Bis-oxonol Záporný náboj Akumulace v depolarizovaných buňkách Vazba na nepolární kompartmenty

DiOC2(3), Rhodamin 123 Pichia - mix Saccharomyces - mix Thermus vitální fixované

BOX

Esterázová aktivita Fluorescein diacetát Karboxyfluorescein diacetát lipofilní, nenabitá a nefluorescentní sonda, snadno prochází buněčnými membránami, v buňkách je hydrolyzována nespecifickými esterázami na anion fluoresceinu špatná retence v buňkách Karboxyfluorescein diacetát podobné vlastnosti jako FDA větší molekula, hůř prochází neporušenými membránami lepší zádrž produktu v buňce

FDA - viabilita Saccharomyces Histogram pichia fda

CFDA Saccharomyces, Pichia Thermus vitální vzorek - nízká fluorescence fixované buňky - vysoká fluorescence Thermus vitální vzorek - jasná fluorescence fixované buňky - téměř bez fluorescence

FDA – esterázová aktivita

DNA – buněčný cyklus, FITC interakce s neprotonovanými alifatickými amino-skupinami → s N-koncem polypeptidu a ε-aminoskupinou lysinu Srovnání s biuretovým spektrofotometrickým stanovením

Statistické vyhodnocení - opakovatelnost PI FDA CFDA DiOC2(3) Rh 123 BOX Saccharomyces SD 0,4 0,48   1,89 3,06 1,36 RSD 0,79 0,92 2,5 5,04 3,08 Pichia 0,75 1,22 2,87 1,11 2,59 1,91 4,5 3,28 Thermus 1,52 2,72 0,52 2,74 2,65 2,1 3,63 1,12 3,96 3,42 3,69

Děkuji za pozornost