Současné trendy v klinické imunologii a sérologii JAN MARTINEK
OSNOVA Základní principy metod v imunologii a sérologii Imunoglobuliny Problematika infekční sérologie (vybrané infekční agens)
Principy metod v imunologie a sérologii - DĚLENÍ METOD Humorální Buněčné
Metody nefelometrie a turbidimetrie Stanovení: proteiny akutní fáze, složky komplementu, podtřídy IgG Princip: měření intenzity světla precipitace v roztoku – přímé měření množství precipitátu - zákal kvantitativní stanovení (kalibrační křivka)
Elektroforéza Stanovení: Orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí imunoglobulínů - především Princip: Proteiny mají el. náboj podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , , - frakce ). možnost denzitometrické kvantifikace
E L E K T R O F O R É Z A
I M U N O F I X A C E
Metody – EIA Stanovení: infekční sérologie, autoprotilátky, tumor. Markery, spec. IgE … Princip: Specifická interakce mezi antigenu a protilátky s následným stanovením Typy: ELISA, FEIA, ELISPOT, CLIA, , CLIA, ECLIA, MEIA …
Metoda – ELISA Princip: komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) se odstraní promytím vysoká citlivost (1ng/l)
ELISA – průkaz antigenu
TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA
METODA CLIA – ADVIA CENTAUR
Metoda – WB, Imunodot Stanovení: Infekčních, autoimunitních, spec. IgE …
WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)
Metoda – IFA Stanovení: Především autoimunitních parametrů a dále infekční agens
NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE
Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko Autoprotilátky na HEp-2 buňkách : Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko separační zóna buňky Jaderné autoantigeny polynukleotidy histony ribonukleoproteiny antigeny jadérek centroméra další antigeny Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny
Komplement fixace a hemaglutinace komplement-fixační reakce je založena na vyvazování komplementu z reakčních směsí specifickými komplexy Ag s Ab – spotřeba komplementu. V druhém kroku je stanovena hemolytická aktivita komplementu (nepřítomnost protilátky se projeví lýzou). Testem jsou prokazovány směsné protilátky (nelze samostatně prokázat např. IgM). aglutinace na nosičích je precipitace převedená na aglutinaci , nejčastěji latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (HA). Všechny typy aglutinace na nosičích jsou vysoce citlivými reakcemi k důkazu protilátek.
NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE
Testy Buněčné imunity Funkční testy leukocytů Stanovení počtu buněk
Funkční testy Fagocytosa – od metod diagnostikovaným pod mikroskopem až po aplikace na průtokovým cytometrem Fagocytosa aplikace průtoková cytometrie – využití principu, že při fagocytoze vznikají kyslíkové radikály → oxidace dihydrorodaminu na rodamin (fluorescence)
Funkční testy Basotest Aktivita NK buněk Blastická transformace lymfocytů
Stanovení počtu Význam: především diagnostika imunodeficitů a leukemií
PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE vrchol současných možností analýzy buněčných suspenzí částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady cytometrie určuje: - počet - velikost (FS) -„morfologii“ buněk (SS) - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) údaje získané pro jednotlivé buňky jsou vyhodnoceny počítačem
Fluorochrom je konjugován s primární protilátkou
Vyjadřování výsledků - EIA metody Index pozitivity – Cut off (referenční sérum) 0-0,9 – negativní 0,9-1,1 – hraniční >1,1 - pozitivní Kalibrační křivka – standardy
Vyjadřování výsledků - IFA metody Subjektivní hodnocení, komentář Hraniční Slabě pozitivní Pozitivní Silně pozitivní
Vyjadřování výsledků – metody WB, Imunodot Semikvantitativní hodnocení, komentář Subjektivní hodnocení v kombinaci se software
Vyjadřování výsledků – průtoková cytometrie Procentuální vyjádření jednotlivých subpopulací s návazností na hematologické parametry (Le, Ly) U hematologických pacientů komentář
MULTIPLEXY V širším slova smyslu, jakákoliv metody, kdy stanovujeme najednou (reakční prostor) více parametrů, př. „linedot“ Dnes spojeno s tzv. „microarray“ – stanovení genové exprese, proteinového profilu, ne v rutinním provozu
„Kuličkové“ Multiplexy Směs „kuliček“ různé velikosti a barvy potažené antigeny Detekce jakýchkoli protilátek Není zatím v rutinní praxi
IMUNOGLOBULINY A B-LYMFOCYTY
Hemopoéza
BCR receptor, Imunoglobuliny
GENETICKÁ ORGANIZACE IgH VH DH JH S Cm C C 3 C 1 C C1 C 2 C 4 C C 2 Lokalizace genu v genomu: Těžký řetězec – 14 chromozom Lehký řetězec – λ – 2 chromozom k – 22 chromozom
Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)
Diferenciace B-lymfocytů Diferenciace na antigenu nezávislá – v KD, změna membránové výbavy, přeskupení genu pro receptor Diferenciace na antigenu závislá – sekundární lymfatické orgány, somatická mutace (změny v genu BCR v přítomnosti antigenu, selekce klonu), izotypový přesmyk
CHARAKTERISTIKA PROTILÁTEK
DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
ONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA INFEKČNÍCH NEMOCÍ: PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR
NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ Stanovení protilátek obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) retrospektivní nález (epidemiologie) Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM
DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI čas IgG IgA IgM Množství protilátek
EBV
Souhrn - EBV Čeleď Herpesviridae, DNA virus Kosmopolitně Rozvojové země – v dětství, západní země – až adolescence Celoživotní nosičství (latentní infekce organismu) - perzistence v organismu, brána vstupu: buňky nosohltanu, latentní infekce lymfocytů B (transformace v permanentní buněčné linie)
EBV - Protilátky Neoantigeny – produkce heterofilních protilátek – Paul-Bunnell, Ericsonův test Nalezáme protilátky proti- VCA, EBNA, EA
Dynamika tvorby protilátek
Latentní fáze Latentní fáze – virová DNA se synchronně dělí s buněčnou DNA EBV – latentní proteiny – regulační fce, onkogenní potenciál
Lytická fáze Lytická fáze – přerušení latentní fáze a produkce infekční virionů Lytická fáze – Klidové lymfocyty se mění na proliferující buňky – transformace neboli imortalizace lymfocytů Lytická fáze – selhání složek infekce – chronická EBV infekce, nádorů asoc. S EBV, imunodeficity Lytická fáze EBV infekce – analog IL10 – inhibice makrofágů a Th1 lymfo
EBV - Nádory, genetika Epidemiologie a mol. Biologie – EBV se účastní řady procesů vedoucích k maligním onemocněním Gen. změny, reg. b. dělení, dif. a exp. povrch molekul, … Nazofaryngeální karcinom (jihovýchodní Asie) Burkittův lymfom Hodgkinův lymfom Dále vztav k lymfoproliferativním onemocněním spojených s vrozenou nebo získanou imunodeficiencí (X- vázaný lymfoprof. Syndrom, Wiskott-Aldrich syndrom, Ataxia teleangiectazia), (HIV)
Chlamydie - Charakteristika •„atypickébakterie“bez buněčnéstěny z peptidoglykanu •intracelulárnírůst •bez vlastního energetického metabolismu •=> nelze je kultivovat na k. půdách, jen na tkáňových kulturách •=> nelze použít ATB, kterápůsobína bakteriálnístěnu (beta-laktamováATB) •růstový cyklus 48-72h =>dlouhádoba léčby 2-3 týdny
Chlamydie - Druhy •Chlamydia pneumoniae –původce bronchitid, pneumonii, sinusitid. –aterosklerózy ??? •Chlamydia trachomatis •původce: zánětůurogenitálního traktu, inkluzníkonjunktivitidy(s. D-K) •lymfogranulomavenereum(sérotypyL1, L2, L2a,L3) •trachom (serotypyA, B, Ba, C) •Chlamydia psittaci –původce „papouščínemoci“ •Chlamydia pecorum
Chlamydie - Diagnostika Ch. trachomatis – detekce z výtěru a moči, punktát – PCR Sérologie – ELISA + WB, Detekce LPS + MOMP Sérologie – neznalost dynamiky tvorby protilátek, promořenost populace, problém odlišení chronické infekce
Hodnocení protilátek u Chlamydií IgM IgA IgG Hodnocení - Negativní nález (falešně neg. v příliš časné fázi infekce) + Možná počínající infekce. Vhodné opakovat vyšetření za 14 dní +- Akutní infekce na počátku Probíhající infekce Perzist.IgG po proběhlé infekci Chronická či proběhlá infekce, posuzovat dle kliniky
Borrelie Diagnostika především nepřímá – ELISA následná konfirmace WB Nesrovnalosti mezi výrobci
Děkuji za pozornost