Analytická fáze klinicko - biochemického vyšetření pacienta Ing. Andrea Gruberová Doc. MUDr. Petr Čechák, CSc. Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV a 3 LF UK 2006/2007

Fáze laboratorního vyšetření : preanalytická - definována jako postupy a operace od požadavku na vyšetření až po zahájení analýzy vzorku, tj. skládá se z přípravy nemocného na odběr vyšetření, odběru biologického materiálu, jeho uchování a transportu do laboratoře analytická - je prováděna v laboratoři v souladu s postupy správné laboratorní praxe - zahrnuje vnitřní a vnější kontrolu kvality, které by měly minimalizovat chyby analytického procesu postanalytická - Jedná se o interpretaci výsledků stanovení ve vztahu k fyziologickým hodnotám (bývají udávány jako referenční meze), k výsledkům dalších vyšetření laboratorního komplementu a zobrazovacích metod a ke klinickému obrazu pacienta (anamnéze, objektivnímu nálezu)

Časové rozdělení jednotlivých fází biochemického vyšetření

Analytická fáze laboratorního vyšetření Jedná se o tu část laboratorního vyšetření, která je doménou laboratoře, tj. o vlastní analýzu. Je zajišťována analytickými chemiky, biochemiky a zdravotními laboranty a prováděna v souladu s postupy správné laboratorní praxe (interní a externí kontrola kvality). Stanovení daného analytu může být prováděno celou řadou metodik, tj. analytických postupů, které ovšem mohou mít různou vypovídací hodnotu. S rozvojem řady technologií v našem století se přesnost a spolehlivost metod výrazně zvýšila. Příkladem může být stanovování stopových prvků, kdy v průběhu dvaceti let normální hodnoty poklesly až stonásobně.

Druhy biologického materiálu v laboratoři : sérum - nažloutlá tekutina, která vzniká po sražení krve (krevní buňky s některými bílkovinami vytvoří koagulum a s. je vytlačeno ven). Je podobné plasmě, ale neobsahuje některé bílkoviny, které jsou nutné ke vzniku sraženiny a které se při její tvorbě spotřebovaly plasma - nažloutlá tekutina, která je spolu s krvinkami v ní obsaženými základem krve. Obsahuje 90 % vody, 8 % bílkovin (albumin, globuliny, fibrinogen, koagulační faktory, imunoglobuliny aj.), soli, glukosu, lipidy, žlučová barviva, hormony, vitaminy, odpadní látky aj. - lze získat odstředěním nesrážlivé krve, tj. krve odebrané do stříkačky nebo zkumavky obsahující protisrážlivé látky – citrát nebo heparin punktát – materiál získaný punkcí moč likvor stolice slzy

Metody (podle principu) : chemické fyzikální imunochemické m. vyšetřování nukleových kyselin chromatografické

Metody chemické : optické elektrochemické elektroforetické

Metody optické : Absorpční fotometrie A . . . absorbance zabývá se kvantitativním hodnocením změny intenzity záření po průchodu analytickým prostředím absorbance je přímo úměrná látkové koncentraci a tloušťce absorbující vrstvy platí Lambertův-Beerův-Bougnerův zákon : A = a . c . l A . . . absorbance a . . . absorpční koeficient pro danou λ (vlnová délka) c . . . koncentrace roztoku l . . . délka optické dráhy (tloušťka vrstvy roztoku) - přístroje : - jednopaprskové - absorpční fotometry - dvoupaprskové roztok spektrofotometry blank (slepá zkouška) s rozvojem automatických analyzátorů výzkum

Metody optické – pokračování : Reflexní fotometrie – sleduje se odražené záření od homogenně zbarvené podložky - použití : pro kvantitativní vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi se suchými činidly po jejich aktivaci vodou obsaženou v měřeném vzorku Plamenová emisní fotometrie – měří se intenzita zbarvení plamene, k emisi záření charakteristické délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) na původní dráhy použití : pro stanovení koncentrace sodných a draselných iontů v séru či v moči, lithia a vápníku nátrémie - závislá na obsahu bílkovin a lipidů v plazmě kde se patologicky zvyšují falešně snížená nátrémie (tzv. pseudohyponátrémie)

Metody optické – pokračování : Fluorimetrie – využívá se jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla vzniká fotoluminiscence; látky při tom vyzařují světlo, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci fluoreskující sloučeniny Použití : zejména pro detekci v imunochemii Turbidimetrie – založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích měří se stupeň zákalu - turbidita - použití : imunochemické metody Nefelometrie – měření intenzity difuzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření - použití : pro reakce antigen-protilátka, je o řád citlivější než turbidimetrie

Metody optické – pokračování : Chemiluminiscence – excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po nástřiku syntetizovaného činidla, nebo se použije biologická substance (bioluminiscence) nebo se k excitaci činidel využívá oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence) přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) světelná emise

Elektrochemické metody : Potenciometrie – měří se rozdíl potenciálů (napětí) mezi dvěma elektrodami; jedna elda – referenční (srovnávací) – konstantní potenciál; druhá elda – indikační (měrná) – potenciál závisí na aktivitě měřeného analytu ve zkoumaném vzorku - použití : stanovení sodných, draselných, lithných, vápenatých, hořečnatých a amonných kationtů, chloridových aniontů a oxid uhličitý - pH - astrup - skleněná elda - ISE Ampérometrie – měření proudu za konstantního potenciálu - amperometr slouží jako detektor elektronů v oxidačně-redukčních reakcích při stanovení glukozy, sleduje se množství elektronů uvolněných při doprovodné reakci Fe2+ Fe3+ + e- všechny moderní glukometry

Elektrochemické metody - pokračování : Polarografie – měří se intenzita proudu při konstantním vnějším potenciálu (přepětí) Clarkova Elda – slouží ke stanovení množství kyslíku; kyslík rozpuštěný ve vzorku nebo v pufru difunduje přes hydrofobní membránu propustnou pro plyny ke katodě (z platiny), jako anoda slouží Ag/AgCl elda; použití u acidobazických analyzátorů k měření parciálního tlaku kyslíku Coulometrie – ke stanovení koncentrace v roztoku se používá měření prošlého náboje při elektrochemické reakci - použití : Stanovení chloridů, ale většinou se neužívá, vyžaduje separátní zpracování vzorku (na Cl- se používá spíše fotometrické stanovení) Konduktometrie – založená na měření vodivosti analyzovaného roztoku, měří se vodivost mezi dvěma platinovými elektrodami - elektrická vodivost roztoku závisí na koncentraci iontů, jejich pohyblivosti, disociaci a teplotě roztoku - použití : pro stanovení močoviny a hematokritu a zejména pro sledování čistoty destilované vody

Elektroforetické metody : Zónová elektroforeza – založena na rozdílu pohyblivosti částic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul a vlastnostech prostředí - jako nosič se využívá acetylcelulóza nebo různé gely (agarový, agarózový nebo polyakrylamidový) - dělení na acetylcelulózových, agarových a agarózových fóliích – dochází k distribuci podle velikosti náboje; po ukončení dělení se jednotlivé složky fixují a barví; pak se fólie odbarví, popř. zprůsvitní a vysuší - dělení na polyakrylamidovém gelu – látky se dělí nejen podle elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul; efekt molekulového síta – polyakrylamidový gel s gradientem hustoty, přidá se laurylsíran sodný (SDS) a všechny molekuly mají téměř stejný náboj a dělí se jen podle velikosti - vyhodnocení – provádí se na denzitometru – elektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky; v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření; to se projeví při jeho dopadu na čidlo a převodu signálu na analogový záznam; po zpracování integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých elektroforetických frakcí - použití : ke stanovení frakcí bílkovin, lipoproteinů, glykoproteinů a jednotlivých izoenzymů

Fyzikální metody : Osmometrie – měření osmolality v séru a moči - osmotický tlak – tlak rozpuštěných, zejména nízkomolekulárních látek a iontů v roztoku odděleném polopropustnou membránou od samotného rozpouštědla - přímo úměrný celkovému počtu rozpuštěných nebo disociovaných částic - pokud látka disociuje každá disociovaná část je osmoticky aktivní částicí - nedisociovaná látka - jen jedna osmoticky aktivní částice - osmolalita (mmol/kg)– látková koncentrace osmoticky aktivních částic v 1 kg rozpouštědla - orientační výpočet osmolality : osmolalita = 2 [Na+]+[močovina]+[glukóza]

Fyzikální metody - pokračování : Onkometrie onkotický tlak - koloidně osmotický tlak plazmatických bílkovin v kPa onkometry v KB - použití vzácně, většinou součástí přístrojové výbavy jednotek intenzivní péče a ARO

Chromatografické metody : Chromatografie na tenkých vrstvách – využívá se principu rozdělovací, adsorpční, ionexové i afinitní chromatografie - vzorky se nanášejí pipetou na hliníkovou fólii s litým silikagelem nebo oxidem hlinitým a vyvíjí se v chromatografické komoře v soustavě rozpouštědel v klinické biochemii se používá méně než v minulosti a dává se přednost exaktnějším metodám Plynová chromatografie – mobilní fáze je plynná a také separované složky jsou v plynném stavu - stacionární fáze může být tuhá látka (separace na principu adsorpce nebo sítového efektu) nebo kapalina zakotvená na nosiči (rozděluje se složka mezi kapalnou stacionární a plynnou mobilní fázi) - stacionární fáze v obou případech působí selektivně na jednotlivé separované látky a na základě vzájemných interakcí dochází k rozdělení (retenci, zadržování) jednotlivých složek v koloně k jejich rozdílné eluci - rozdělené složky jsou unášeny nosným plynem z kolony a jejich množství je zaznamenáváno detektorem

Chromatografické metody - pokračování : Kapalinová chromatografie – mobilní fáze je kapalná v chromatografických kolonách látky se dělí ve dvoufázovém dělícím systému na základě adsorpce, výměny iontů, fyzikální distribuce látek mezi kapalnou mobilní a s ní nemísitelnou kapalnou stacionární fází nebo na principu pronikání molekul z mobilní fáze do pórů tuhých částic, které mají funkci molekulového síta

Metody imunochemické : založeny na principu reakce antigen – protilátka Protilátka se váže na antigen biospecifickou vazbou Antigen – vysokomolekulární látka, která je schopná vyvolat v živém organismu imunitní odpověď, namířenou specificky proti použitému antigenu - bílkoviny, glykoproteiny, polysacharidy a lipopolysacharidy, nukleotidy Protilátky (imunoglobuliny) – bílkoviny, vykazující specifickou vazebnou aktivitu vůči antigenu, na jehož podnět se v organismu vytvořily - jejich úkol – chránit organismus proti infekci - glykoproteiny

Metody vyšetřování nukleových kyselin : založeny na studiu DNA (resp. RNA) Metoda PCR – polymerázová řetězová reakce pomocí ní měříme několik kopií některé DNA sekvence lidského genomu amplifikací pomnožení, mnohonásobné kopírování - proces, kdy z několika málo kopií jedné molekuly (sekvence nukleotidů) získáme milion- i vícenásobek

Metody : kvalitativní - drogy, těhotenské testy kvantitativní princip sendvičové analýzy kvantitativní semikvantitativní – vypovídá už také o množství hledané látky - hodnocení - pomocí arbitrálních jednotek (0, 1, 2, 3, 4) - hodnocení na kříže - interval ohraničený kvantitativními hodnotami koncentrace - obvykle subjektivní vizuální hodnocení - nejčastěji proužky, zkumavky, jamky mikrotitračních destiček, plotny pro tenkovrstevnou chromatografii, jednoúčelné zkumavky, sklíčka … - detekce - oko, mikroskop, reflexní fotometrie, infračervená spektrofotometrie, kapilární elektroforéza atd.

Jednotky v klinické biochemii : Mezinárodní soustava jednotek SI – přijata v roce 1977 Použití jednotek: většina analytů – v látkové koncentraci (mmol/l, mikromol/l,nmol/l) všechny bílkoviny – v hmotnostní koncentraci (g/l, mg/l) hemoglobin – v hmotnostní koncentraci (g/l) enzymová aktivita – mikrokat/l, nkat/l parciální tlaky pO2 a pCO2 – kPa

Rozdělení vyšetřovacích metod „Mokrá chemie“ – reakce dvou roztoků „Suchá chemie“ – reakce na tzv. stripu

„Mokrá chemie“

„Mokrá chemie“

„Suchá chemie“

„Suchá chemie“ kolorimetrie rozdělovací vrstva reakční vrstva semipermeabilní membrána detekční vrstva nosná vrstva

potenciometrie iontově-selektivní membrána referenční vrstva elektroda Ag/AgCl

imunologie rozdělovací vrstva reakční vrstva gelová vrstva nosná vrstva

SOP

Metody stanovení glukozy MS s izotopovým zřeďováním Hexokinásová metoda (referenční metoda) Glukosaoxidasová metoda Glukosadehydrogenasová metoda Elektrochemické metody

1. MS s izotopovým zřeďováním ke vzorku se přidá známé množství glukozy, značené uhlíkem 14C složitým způsobem se provede derivatizace glukozy těkavý derivát se separuje plynovou chromatografií hmotnostní spektrometrií se určí poměr glukozy 12C a 14C z poměru izotopů a známého přídavku lze určit koncentraci glukozy ve vzorku vyžaduje speciální vybavení trvá 2 dny nejblíže se dělá v Německu

2. Hexokinázová metoda katalýzy hexokinásou : fosfátová skupina z ATP se váže na glukozy katalýza glukosa-6-fosfátdehydrogenasou : oxidace glukosa-6-fosfátu na 6- fosfoglukonát - oxidační činidlo NADP+ se přitom redukuje na NADPH2 růst absorbance při 340 nm referenční metoda vysoká specifita reakce stanovení ruší hemolýza a léčiva absorbující v UV

3. Glukosaoxidasová metoda ß-D-glukosa je oxidována FAD na 5-glukonolakton za katalýzy glukosaoxidasou redukovaná forma FADH2 se vzdušným kyslíkem samovolně oxiduje zpět na FAD a O2 se redukuje na H2O2 vznikající 5-glukonolakton samovolně hydrolyzuje na kyselinu glukonovou Trinderova reakce – POD katalyzuje oxidaci různých chromogenních akceptorů peroxidem vodíku zbarvení obvykle červené nejpoužívanější reakce v českých zemích

Trinderova reakce

4. Glukosadehydrogenasová metoda glukoza se může oxidovat na 5-glukonolakton také pomocí NAD+ za katalýzy glukosadehydrogenasou oxidační činidlo se redukuje na NADH2 odpovídající přírůstek absorbance se sleduje při 340 nm v česku se nevyužívá, v USA ano

5. Elektrochemické metody úbytek O2 při oxidaci glukosy v přítomnosti GOD a katalasy lze sledovat polarograficky Clarkovou kyslíkovou elektrodou (analyzátory Beckman) využití enzymové elektrody s imobilizovanou GOD na elektrodové membráně (analyzátory Eppendorf)

Vztah mezi koncentrací/aktivitou a signálem Koncentrace – vyjadřuje se v hmotnostních nebo objemových jednotkách Aktivita – definovaný účinek za definovaných podmínek Matematický vztah – jednoznačný a za definovaných podmínek stejný analysa je možná – užití standardů a kontrol

Kalibrace a kontroly Kalibrace – standardy opřené o referenční metody stanovení obsahu Kontroly – analysované referenčními metodami nebo standardisovanými metodami na více pracovištích Kalibrace a kontroly – stejné chování jako měřené vzorky

Statistika v analýze : Průměr Rozptyl Standartní směrodatná odchylka Chyby měření : - hrubé - vznikají selhání pracovníka nebo přístroje nebo použitím nevhodné metody analýzy - vznikají obvykle jednorázově v důsledku vyjímečné příčiny - systematické - soustavné, s konkrétní předvídatelnou příčinou - stálý charakter, známá příčina - náhodné - zcela nepravidelně, v důsledku působení náhodných vlivů - ovlivňují přesnost výsledku Správnost Přesnost Systém kontroly kvality (vnitřní a vnější) – další seminář

Přesnost Míra shody mezi výsledky získanými opakovanou analýzou téhož vzorku za předem stanovených podmínek Počet stanovení – min. 20 Podle podmínek stanovení se dělí : - p. v sérii (opakovatelnost) - p. v čase (reprodukovatelnost) - p. mezilaboratorní Absolutní přesnost nelze nikdy docílit, náhodné chyby způsobují, že jsou výsledky rovnoměrně rozptýleny kolem průměrné hodnoty, přičemž četnost jednotlivých výsledků vykazuje normální rozložení (Gaussova křivka)

Matematicky Vyjadřujeme nepřesnost Míra rozptylu nepřesnosti – směrodatná odchylka : ‡”( xi – x )2 xi – výsledky jednotlivých měření s = x – aritmetický průměr n - 1 n – počet měření Protože velikost směrodatné odchylky závisí na měřené hodnotě – počítá se tzv. relativní směrodatná odchylka (variační koeficient) : s VC = ( . 100) x

Správnost Shoda mezi výsledkem měření a skutečnou hodnotou Vlastnost laboratorního měření vykázat/nevykázat chybu menší než požadovanou Funkcí náhodné a systematické chyby měření Srovnává se očekávaná hodnota (xo) s aritmetickým průměrem opakovaných měření kontrolního vzorku ( x ) eliminována náhodná chyba měření

Nesprávnost x – xo . 100 (%) xo Způsobena systematickou chybou při analýze Odchyluje výsledky vždy jedním směrem Matematicky : - chyba absolutní, bias, vychýlení : ( x – x0 ) - chyba relativní (vztažena ke správné hodnotě) : x – xo . 100 (%) xo

Vývoj v analytické chemii Eliminace vlivu ruční práce na výsledek měření Programové automaty s využitím PC Metody standardisované, referenční Standardy opřené o referenční materiály/metody Kontrolní laboratorní systém se opírá o vhodné kontrolní materiály (fy Bio-Rad, SEKK, Instand) Dokumentace metod - SOP

Výstup výsledků : - přepis ze sešitu do LIS - přenos on-line z přístrojů do LIS Kontrola a editace výsledků LIS, NIS Dynamické sledování výsledků Papírová dokumentace – pro lékaře - pro laboratoř – hlavní kniha, pracovní listy a sešity, výtisky archivace dat

POCT point of care testing – analysa u lůžka pacienta Požadavky : - rychlost stanovení - snadná obsluha - shoda výsledků s akceptovanými či standardisovanými metodami - nízká cena - snadná dosažitelnost vzorku (malý objem krve) Použití : - ARO + operační sály - záchranná služba - laboratorní kout - praktický lékař - vyšetřování v domácnosti

Děkuji za pozornost !