Imunohistochemie (IHC)

principy imunohistochemie IHC principy imunohistochemie

= vazba molekul imunoglobulinů (Ig) s jinými molekulami princip imuno- metod = vazba molekul imunoglobulinů (Ig) s jinými molekulami

imunohistochemie (ihc): všechny techniky využívající mono-či polyklonální značené protilátky (Ab), kterými lokalizujeme a vizualizujeme příslušné tkáň. antigeny (Ag) vztah klíče (Ab, volná) a zámku (Ag, tkáň. Ag)

základní typy ihc metod přímá: primární Ab značená přímo nepřímá dvojstupňová: imunologická vazba sekundární značené Ab na Ab primární nepřímá trojstupňová: např. streptavidin-biotin-komplex (SABC)

ad 1) přímá metoda primární Ab značená přímo nutná dostatečná koncentrace hledaného Ag ve tkáni nativní řezy (pro parafín málo citlivé)

ad 2) nepřímá dvojstupňová komplikovanější na přípravu x citlivější první „vrstva“: neoznačená Ab (Ig nebo sérum) specifická pro hledaný tkáň. Ag = primární Ab druhá „vrstva“: značená Ab proti Fc fragmentu primární protilátky = sekundární Ab, vazba imunologická

ad 3) nepřímá trojstupňová amplifikační = zesílení signálu při malém množství molekul Ag ve tkáni primární specifické antisérum proti Ag prokazovanému ve tkáni neznačená specifická Ab proti primární = spojovací = můstek značený komplex streptavidinbiotin(SABC)

typy Ab polyklonální: monoklonální: mnoho aktivovaných klonů B lymfocytů proti různým oblastem určitého Ag nebo proti směsi Ag vysoká senzitivita x nízká specifita monoklonální: 1 klon nízká senzitivita x vysoká specifita

značení Ab fluorescenční značky enzymy: např. peroxidáza

obecné schéma ihc protokolu odběr a fixace tkáně krájení a napínání řezů optimalizace prezentace Ag blok aktivity endogenních enzymů blok pozadí

obecné schéma ihc protokolu vazba primární Ab vazba sekundární Ab detekční systém demaskování komplexu Ag-Ab barvení pozadí (buň. jader) dehydratace a montáž preparátu

ad 1) odběr a fixace pro ihc skloubení zachování morfologie x zachování antigenicity a minimalizace artefaktů průkaz Ag nutno in situ (v místě norma výskytu ve tkáni během fixace artefakty fixace pufrovaným neutrálním formalínem

ad 2) krájení a napínání napnutí na kapce vody skla potažená lepivou hmotou bílek-glycerin želatina poly L-lysin APES (3-amino-propyl-triethoxysilan) účinná a trvanlivá! (var v MT, lázni)

ad 3) optimalizace prezentace Ag lepší fixace x horší prokazatelnost tkáň. Ag ošetření tkáň. řezů, aby povrchy lépe „nabízely“ Ag = regenerace Ag (Ag retriever) snižují přilnavost k povrchům

ad 3) optimalizace prezentace Ag použití proteáz MT vodní lázeň

ad 4) blok endogenní aktivity enzymů pro průkaz vazby Ag-Ab běžně použití Ab značených enzymem (peroxidáza…) přirozený výskyt ve tkáni – falešně pozitivní výsledky reakcí

ad 4) blok endogenní aktivity enzymů blok endogenní peroxidázy! 1-3% H2O2 v methanolu nebo destil. H2O po dobu 20 – 30 min blokování avidinu a biotinu (ledviny a játra) blok s 0,1 – 0,01% avidin v PBS 20 min a následně blok 0,01 – 0,001% biotinem v PBS 20 min

ad 5) blok pozadí nespec. reakce pozadí – falešná pozitivita falešně pozit. nespecifická reakce pozadí: aktivita endogenních tkáň. enzymů (vysycení enzymů jejich substrátem) endogenní avidin-biotinová reakce (endogenní biotin: játra, ledviny, tuk. tkáň., mléčná žláza) kontaminace řezů nebo reagencií cizorod. látkami

ad 5) blok pozadí křížové reakce (zkřížená reaktivita) Ab s podobnými epitopy na různých Ag nespecif. vazba primární Ab na kolagen, laminin, elastin, proteoglykany, keratin, tuk. tkáň a jiné pojiv. struktury (důsledek fixace aldehydy) nespecif. vazby v důsledku elektrostat. interakcí poškození řezu (vyschnutí!)

ad 5) blok pozadí difúze tkáň. Ag do okolí nespec. reakce sekundární, popř. terciární Ab s Fc receptory imunoglobulinů ve tkáni (cytoplazmat. membrány, často makrofágy a granulocyty) Ag pohlcen makrofágy nekróza tkáně (vylití cytoplazmat. obsahu do mezibuň. prostoru)

ad 5) blok pozadí nespecifickému vychytávání spec. Ab předcházíme vysycením tkáně bílkovinami (nespec. sérem nebo mlékem) – tkáň se saturuje „neškodnými“ bílkovinami a nespec. přibarvování pozadí je menší

ad 6-8) vazba Ab a detekčního systému reakce tkáň. Ag s primární – sekundární – terciární Ab = přítomnost chromogenu v místě, kde došlo ke spec. vazbě reakce Ag-Ab nejlépe při neutrálním pH příbalový leták spec. Ab (fixovaná x zmražená tkáň, doporučené ředění…)

ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny vazba Ag-Ab bez viditelné reakce! pro využití světel. mikroskopu nutno vizualizovat = použití chromogenů imunofluorescenční imunoenzymové: peroxidáza produkt činnosti peroxidázy je nerozpustný pigment

ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny enzymatická reakce = vhodné podmínky (optimální teplota, pH, iont. síla roztoku, poměr mezi enzymem a substrátem, nepřítomnost inhibitorů…) peroxidáza + DAB = stabilní hnědý produkt, nerozpustný v alkoholu (nevyplaví se při dehydrataci řezů)

ad 10) dobarvování pozadí orientace v preparátu – dobarvení jader hematoxylinem