Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Autor - Jana HRONOVÁ, spoluautoři: Alena Hnátková, Petra Koutová Patologicko-anatomické oddělení Karlovarské krajské nemocnice a. s.

1. Schéma stavby kosti

2. Histologická stavba kosti Specializovaná pojivová tkáň složená ze zvápenatělé mezibuněčné hmoty – kostní matrix a tří různých typů buněk (osteocytů, osteoblastů a osteoklastů). Kostní matrix je tvořena převážně vápníkem a fosforem tvořícími krystalky hydroxyapatitu. Organická hmota je tvořena kolagenem typu I a amorfní základní hmotou. Spojení hydroxyapatitu s kolagenními fibrilami zajišťuje kosti charakteristickou tvrdost a pružnost.

3. Princip odvápňování kostní tkáně K odvápnění tvrdých tkání byla vypracována řada metodik, založených na rozpuštění minerální komponenty nejčastěji účinky slabých roztoků kyselin, např. kyseliny dusičné, kyseliny mravenčí, chelatonu…

4. Zpracování kosti před odvápňováním Zhodnocení velikosti vzorku (větší kost nařezat na lamely cca 5 mm). Dostatečná fixace ve fixační tekutině (např. formol 24-48 hod.) Vypírání v tekoucí vodě po dobu 1 hod.

5. Postup při odvápňování kosti Tkáň musí být fixovaná, doba fixace 24 - 48 hod. Při nedostatečné fixaci hrozí poškození tkáně. Po fixaci musí být z tkáně odstraněna fixační tekutina vypíráním v 70% etanolu nebo tekoucí vodovodní vodě po dobu 1 hod. Odvápnění musí být rychlé. Doba odvápnění se řídí podle velikosti tkáňového bločku, druhu dekalcifikační tekutiny. Doba trvání několik dnů. Po skončení odvápňování musí být dokonale odstraněna dekalcifikační tekutina vypráním v některé ze solí (kamenec sodný, borax).

6. Odvápnění 10% kyselinou dusičnou vypírání fix.tekutiny v tekoucí vodě………..1 hod. 10% kyselina dusičná……………….do odvápnění neutralizace - 5% roztok síranu sodného….…1 hod. vypírání v tekoucí vodě………………………1 hod. ---------------------------------------------------------- dále – odvodnění od 70% etanolu ……… (jako při zpracování běžného parafinového bločku)

7. Odvápnění kyselinou mravenčí vypírání fix.tekutiny v tekoucí vodě……...1 hod. 2,5% kyselina mravenčí.………….do odvápnění (- vždy po 48 hod. vyměnit!) neutralizace 3% roztokem boraxu……….24 hod. vypírání v tekoucí vodě…………………….1 hod. ------------------------------------------------------------- dále - odvodnění od 70% etanolu … (jako při zhotovování běžného parafinového bločku)

8. Zalévání tkáně do parafínu pomocí tkáňového procesoru ODVODNĚNÍ – 70 % etanol, 80 % etanol, 96 % etanol, aceton-xylen (1:1)………4 hod. PROSYCENÍ INTERMÉDIEM – xylen……………..……..1 hod. PROSYCENÍ ZALÉVACÍM MÉDIEM – parafín……..5 hod. VLASTNÍ ZALITÍ – přefiltrovaný parafín zahřátý na teplotu 56°C.

9. Krájení parafinového bloku na sáňkovém mikrotomu

10. Barvení histologického preparátu ODPARAFÍNOVÁNÍ – xylen, xylen, 96% etanol, 80% etanol, 70% etanol, dest.voda BARVENÍ – vybranou technikou OPLACH – dest.vodou ODVODNĚNÍ - 96% etanol (2 lázně), aceton, aceton-xylen (1:1) PROJASNĚNÍ – xylen (2 lázně) ZAMONTOVÁNÍ – překrytí preparátu krycím sklíčkem

11. Mikrofotografie preparátu odvápněného kys. dusičnou

12. Mikrofotografie preparátu odvápněného kys. mravenčí

13. Výsledné zhodnocení: kyselina dusičná x kyselina mravenčí Odvápnění je rychlejší (1 - 4 dny) Odvápnění zhoršuje barvitelnost preparátů – obzvláště jader bb Odvápnění je výrazně pomalejší (u tvrdého materiálu minimálně týden – 14 dní) Odvápnění nemá vliv na barvitelnost jader a buněčných struktur

14. Použitá literatura Obecná a speciální histologie – Karel Dvořák Histologie a histologická technika – Zdeněk Vacek Základy histologie – L. Carlos Junqueira, José Carneiro, Robert O. Kelley

Děkujeme za pozornost