Měření optické aktivity … Přednáška 5 Měření optické aktivity … 4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) 4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) 4.7 Cirkulárně polarizovaná luminiscence 4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) Výpočet spektrálních chiroptických vlastností Aplikace chiroptických metod (hlavně Přednáška 6) CH M 2014 přednáška 5

4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) Ve fluorescenčně detekovaném CD (FDCD) měříme rozdíl v intenzitě fluorescence pro vlevo a vpravo polarizovanou excitaci – vlastně rozdílové excitační spektrum CD: FDCD: Experimentální uspořádání: PMT umístěno pod 90° vzhledem k budícímu paprsku vhodný filtr propouštějící světlo nad určitou vlnovou délku – zabraňuje aby rozptýlené světlo dopadlo na PMT detekující fluorescenci (elastický rozptyl), emise se detekuje jako celková, omezená pouze filtrem, není zde emisní monochromátor 4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT PMT „long pass“ filtr monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT CH M 2014 přednáška 5

Př. Spektra FDCD roztoku (S) a (R)-(-)1,1-Bi-Naphtholu v MeOH, autor Ettore Castiglioni CH M 2014 přednáška 5

Další měřicí mody přístroje pro měření ECD umožňuje simultánní měření CD a fluorescenčních charakteristik vhodné před měřením FDCD a) ECD/fluorescence v hlavní optické ose zapojen velký hlavní fotonásobič kolmo na optickou osu zapojen malý fotonásobič, který měří celkový světelný tok případně omezen filtrem měří se tří kanálově CD spektrum (hlavním fotonásobičem PMT přes lock-in) – hlavní optická dráha voltage ~ absorpčnímu spektru (předzesilovač před lock-inem) – hlavní optická dráha fluorescenční spektrum excitační (proměnná délka excitace, celkový fluorescenční tok omezený filtrem), měří se sekundárním PMT PMT-sekundární „long pass“ filtr monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT-hlavní

Další měřicí mody přístroje pro měření ECD b) ECD/spektrum fluorescence v hlavní optické ose zapojen velký hlavní fotonásobič kolmo na optickou osu zapojen malý monochromátor na něm seshora malý fotonásobič měří se tří kanálově CD spektrum (hlavním fotonásobičem PMT) voltage ~ absorpčnímu spektru fluorescenční spektrum excitační (proměnné délka excitace, nastavitelná vlnová délka emise) nebo jednokanálově buď excitační fluorescenční spektrum (fixní vlnová délka emise na sekundárním monochromátoru a proměnná vlnová délka excitace na hlavním monochromátoru) nebo emisní fluorescenční spektrum (fixní vlnová délka excitace na hlavním monochromátoru a proměnná vlnová délka emise na sekundárním monochromátoru) PMT-sekundární monochromátor-sekundární monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT-hlavní CH M 2014 přednáška 5

4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) přírodní (natural) optická aktivita - vlastnost chirálních molekul magnetická optická aktivita – vlastnost všech molekul 2 hlavní formy: magnetická optická rotace magnet. cirkulární dichroismus (MCD) b) Magnetický cirkulární dichroismus (MCD) magnetické pole vyvolává rozštěpení hladin (sejmutí degenerace spojené s magnetickým kvantovým číslem) „coupling“ důsledkem je odlišná interakce s RCP a LCP záření pro chirální vzorek: přírodní optická aktivita     CH M 2014 přednáška 5

4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) Popis techniky magnetické pole podél směru šíření záření, které prochází vzorkem (paralelní nebo antiparalelní) změna orientace mag. pole – změna znaménka MCD slouží k identifikaci a ověření, že pozorujeme MCD Užití elektronová struktura základního a excitovaných stavů zvětšení rozlišení v absorpčních spektrech (překrývající pásy mohou mit opačné znaménko) studium metaloporfyrinů (Petr Štěpánek, PhD student u doc. Bouře) studium proteinu obsahující hem monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT-hlavní   CH M 2014 přednáška 5

4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) a) Magnetické optická rotace (MOR) tzv. Faradayův jev – stáčení rovina lineárně polarizované záření v závislosti na spektru a na mag. poli, prostředí není chirální http://en.wikipedia.org/wiki/Faraday_effect CH M 2014 přednáška 5

4.7 Cirkulárně polarizovaná luminiscence (CPL) excitace nepolarizovaným záření, emise je analyzována na obsah složky RCP a LCP Měřen: rozdíl fluorescenčního signálu LCP a RCP (excitace nepolarizovaná) Užití: elektronová struktura excitovaných stavů CPL a FDCD někdy spojovány dohromady jako fluorescenční optická aktivita (FOA) CH M 2014 přednáška 5

4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) Náleží spolu s VCD k vibrační optické aktivitě (VOA), protože se testují vibrační hladiny, používá však záření vid., blízké IR (použité obr. z jakéhokoli přehledného článku L. Nafie, např. Annu. Rev. Phys. Chem. 1997. 48:357–86) VCD měří se rozdíl v absorpci LCP a RCP při přechodu mezi vibračními hladinami v základním elektronovém stavu: Ramanova spektroskopie založena na Ramanovu rozptylu (rozptyl: molekula získává energii rovnu rozdílu vibračních hladin, zatímco rozptýlené záření je spektrálně posunuto) měří se rozptýlená intenzita jako spektrální funkce tzv. Stokesova posunu ROA měří kde 𝐼 𝑅 , 𝐼 𝐿 je intenzity rozptylu pojícího se a vpravo a vlevo cirkulárně polarizovaným zářením zavádí se diferenční cirkulární intenzita (circular intensity difference), obdoba dissymmetry factor g Existují 4 formy ROA – na obr. zjednodušeně zobrazena ROA spojená s přechodem jen mezi dvěma vibračními hladinami 𝑅𝑂𝐴=∆𝐼= 𝐼 𝑅 − 𝐼 𝐿 opačná znaménková konvence než v CD ∆= 𝐼 𝑅 − 𝐼 𝐿 𝐼 𝑅 + 𝐼 𝐿 D ~ 10-3

4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) pro srovnání VCD: 4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) ROA - dopadající cirkulární polarizace, incident CP (ICP ROA) Dopadající záření je cirkulárně polarizováno Ramanova intenzita měřena buď pro fixní lin. pol. nebo nepolarizované záření historicky první forma ROA ROA - rozptýlená cirkulární polarizace, scattered CP (SCP ROA) Dopadající záření má fixní lin. pol. , nebo je nepolarizované, Je měřen rozdíl RCP a LCP rozptýleného záření použit v komerčním přístroji ROA - duální polarizace ve fázi, in-phase dual CP (DCPI ROA) Polarizační stav obou – dopadajícího a rozptýleného záření – je synchronně přepínáno mezi RCP a LCP ROA - duální polarizace mimo fázi, out-of-phase dual CP (DCPII ROA) Polarizační stav obou – dopadajícího a rozptýleného záření – je přepínáno mezi RCP a LCP, vždy opačně

4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) Optické schéma spektrometru (Werner Hug)

4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) Vlastní měření vhodná rozpouštědla: na rozdíl od VCD – voda preferována (má slabý Ramanův rozptyl) vhodné tedy pro biomolekuly – proteiny, nukleové kyseliny, cukry, viry redukce fluorescence, která by překryla ROA, žádný prach, deionizovaná voda, milliporové filtry, fluorescenční „burning“ dostatečná koncentrace vzorku stabilita vzorku (ozařuje se laserem) – relativně dlouho (hodiny) a s relativně velkou intenzitou rigidní stabilní chirální molekuly – ROA lze získat za 10 minut v současnosti většinou zpětný rozptyl ve formě SCP ROA fokusace laserového svazku na malý prostor – ml vzorku (rozdíl oproti VCD – tam desítky ml) kyvety pravoúhlé nebo kapilární CH M 2014 přednáška 5

Srovnání VCD a ROA obojí souvisí s vibračními hladinami - VCD transitní dipólový elektrický a magnetický moment, ROA – polarizabilita frekvenční obor: VCD 600-14000 cm-1, ROA 50-4000 cm-1, nad 2000 cm-1 velmi slabé nízké frekvence výhodné pro konformační citlivost biomolekul VCD – velká intenzita pásu amid I a její citlivost na sekundární strukturu ROA – citlivější na amide III ROA 2x dražší než VCD omezený repertoár vzorků pro ROA teorie pro ROA složitější, D závisí na tenzorech: molekulární polarizovatelnost aab (elektrická dipól-dipólová polarizovatelnost) optické aktivity G´ab (elektrická dipól-magnetická dipólová polarizovatelnost) optické aktivity Aabg (elektrická dipól-elektrická kvadrupólová polarizovatelnost) výpočet VCD výpočet snazší, rychlejší, menší požadavek na bázi vlnových funkcí než pro ROA jak VCD, tak ROA mají výhodu oproti ECD – nemusí brát v úvahu systém excitovaných stavů CH M 2014 přednáška 5

5. Výpočet spektrálních chiroptických vlastností 5.1 Obecný postup konformační analýza (používají se dostupné programy jako Hyperchem, MM+) je třeba nalézt všechny konforméry - 2n n, počet chirálních center začíná se trochu nelogicky „odzadu“, strukturu vlastně chceme zjistit 2. optimalizace struktury – hledáme minimum energie a tím zpřesňujeme geometrii (stejnou metodou, jakou se bude počítat pole, nejčastěji metodou teorie elektronové hustoty DFT)

5.1 Obecný postup 3. výpočet sil oscilátorů Dij a rotačních sil Rij (pomocí atomového polárního tenzoru a pomocí atomového axiálního tenzoru) 4. výpočet teoretických spekter pro všechny konforméry zvolíme pološířku pásu a tvar pásy (Gaussův, Lorentzův, smíšený) 5. srovnání s experimentem CH M 2014 přednáška 5

5.2 Základní literatura k ab initio výpočtům Moderní kvantově mechanické výpočty ECD: Density functional theoretical method – teorie elektronové hustoty Diedrich C.; Grimme S. Systematic Investigation of Modern Quantum Chemical Methods to Predict Electronic Circular Dichroism Spectra, J. Phys. Chem. A. 2003, 107, 2524-2539; Pecul M.; Ruud K.; Helgaker T. Density functional theory calculation of electronic circular dichroism using London orbitals, Chem. Phys. Lett. 2004; 388: 110-119; Stephens PJ, McCann DM, Devlin FJ, Cheeseman JR, Frisch MJ. J Am Chem Soc 126 (2004) 7514-7521. Coupled Cluster theoretical method – spřažené klastry Pedersen TB.; Koch H.; Ruud K. Coupled cluster response calculation ofnatural chiroptical spectra, J. Chem. Phys. 1999; 110: 2883-2892; Crawford TD.; Tam MC.; Abrams ML. The current state of ab initio calculations of optical rotation and electronic circular dichroism spectra. J. Phys. Chem. 2007, 111, 12057-12068. CH M 2014 přednáška 5

Moderní kvantově chemické výpočty VCD: Density functional theoretical method - teorie elektronové hustoty J. R. Cheeseman, M. J. Frisch, F. J. Devlin, P. J. Stephens, Ab initio calculation of atomic axial tensors and vibrational rotational strengths using density functional theory, Chem. Phys. Lett. 252 (1996) 211-220. volně dostupný software: DALTON program [www.kjemi.uio.no/software/dalton/ ] komerční Gaussian [www.gaussian.com]; Turbomole [www.turbomole.com]; ADF [www.scm.com] Závěr úspěšně zavedené sofistikované metody pro předpověď VCD (ROA) rozpouštědlový efekt řešen (ne vždy uspokojivě) VCD, popř. ROA spolehlivá metoda nezávislá na ECD/ORD CH M 2014 přednáška 5

6. Aplikace chiroptických metod 6.1 Postavení mezi ostatními strukturními metodami Strukturní metody s vysokým (atomárním) rozlišením rentgenová strukturní analýza, elektronová difrakce, neutronová difrakce (potřebný krystal) NMR (pro velké molekuly problém) rotační a rotačně-vibrační spektroskopie (pro malé molekuly v plynu) numerické metody – modelování skenovací a transmisní mikroskopie Strukturní metody s malým rozlišením – optické spektroskopie UV-VIS spektroskopie a fluorescence jsou orientovány na intenzitu IR a Ramanova spektroskopie orientované na frekvence (polohy spektrálních pásů) CD (ECD a VCD) obsahují informace ve frekvenci, intenzitě a tvaru signálu - lze měřit ve všech fázích, za různých fyzikálně chemických podmínek, rychlé, levnější snaha o vyšší rozlišení např. izotopickou substitucí, spojením s ab initio výpočty CH M 2014 přednáška 5

na případových studiích bude ukázaná kombinace ECD, ORD, VCD, výpočty Kdykoli je to možné, spojit více chiroptických metod, popřípadě podpořit ab intio výpočty na případových studiích bude ukázaná kombinace ECD, ORD, VCD, výpočty Srovnání VCD a ECD z pohledu VCD – výhody a nevýhody vyšší spektrální rozlišení než UV-VIS rozlišení je možné zlepšit např. izotopickou substitucí všechny molekuly vykazují vibrační spektra, nejsou potřebné speciální chromofory charakteristické vibrace jsou lokalizovány v molekule vysoce rozvinutá teorie vibračních spekter, (základní elektronový stav, Born-Oppenheimerova aproximace) potřebná velká koncentrace (pro jednotlivé měření minimálně 2,5 mg vzorku) slabší signály 10-4 - 10-5 A, kde A je absorbance omezená propustnost rozpouštědel v IR oboru – použití deuterovaných rozpouštědel rotační a rotačně-vibrační spektroskopie (pro malé molekuly v plynu) CH M 2014 přednáška 5

Přehled využití podle významnosti detekce chirálního vzorku, jeho enantiomerní čistoty, resp. určení enantiomerního přebytku a čistoty (pro enant. přebytek není to metoda první volby) empirické studium struktury velkých polymerů jako polypeptidů, proteinů, nukleových kyselin bioinspirované interakce (lab. na VŠCHT) porfyrin nebo jiná molekula nebo kov - polypeptid porfyrin nebo jiná molekula nebo kov – DNA polypeptidy – lipidy a surfaktanty bilirubin a biliverdin a jejich vazba na transportní proteiny bilirubin a mutageny, kovové komplexy bilirubinu a biliverdiny, strukturní studie antimutagenních vlastností určování absolutní konfigurace rigidních molekul, včetně farmaceutik konformační studie v roztocích supramolekulární interakce molekulové rozpoznávání CH M 2014 přednáška 5

Aplikace chiroptických metod (Přednáška 6) CH M 2014 přednáška 5