Nukleové kyseliny Jsou universální složky živých organismů. Jsou odpovědné za uchování a přenos genetické informace. Richard Vytášek 2012

Nukleové kyseliny objeveny v 19.století v mlíčí (rybí sperma) a v dalších biologických materiálech funkce objasněna v uplynulém půlstoletí (název odvozen od buněčného jádra [nucleus]) dva základní typy – DNA , RNA v posledních dvaceti pěti letech prudký rozvoj – molekulární biologie a genetika

Složení nukleových kyselin kyselina fosforečná (H3PO4) pentosa (pětiuhlíkatý cukr) D-ribosa 2-deoxy-D-ribosa (RNA) (DNA)

- pyrimidinové base - purinové base heterocyklické base (nukleobase) pyrimidin uracil thymin cytosin (RNA) (DNA) - purinové base purin adenin guanin

Nukleosid je sloučenina  pentosy (ribosy nebo deoxyribosy) a heterocyklické base. Ta je vázána na cukr přes dusík heterocyklu -N-glykosidickou vazbou. Adenosin, guanosin, cytidin, thymidin a uridin adenosin cytidin thymidin

Nukleotid nukleosid esterifikovaný fosforečnou kyselinou buď na 5´-hydroxylové skupině (pouze tyto jsou prekursory nukleových kyselin) nebo řidčeji 3´-hydroxylové skupině. Nukleotidy jsou monomerní jednotky polymerní nukleové kyseliny (polynukleotidu). ribonukleotidy – AMP, GMP, UMP a CMP (monomery RNA) deoxyribonukleotidy – dAMP, dGMP, dTMP a dCMP (monomery DNA) AMP

Nukleová kyselina je polynukleotidový řetězec, který je tvořen mononukleosidy vázanými navzájem fosfodiesterovými vazbami. 5´-OH skupina cukru v nukleotidu je vázána k 3´-OH skupině dalšího nukleotidu fosfodiesterovou vazbou polynukleotidový řetězec obsahuje 5´- a 3´- konec (buď ve formě volné OH skupiny nebo esterifikovaný), dle konvence se sekvence nukleotidů v nukleové kyselině zapisuje od 5´ do 3´konce

RNA

DNA

DNA existuje v nativní formě převážně jako dvojvláknová šroubovice (dvoušroubovice, double helix , duplex)

Obsah nukleobází v DNA různého původu

Párování bází

Dvoušroubovice DNA

Dvoušroubovicová struktura DNA dvoušroubovice je stabilisována vodíkovými můstky nukleotidových párů (A-T, C-G), ale podílí se na ní i další síly (van der Waalsovy, interakce dipol-dipol, odpuzování negativně nabitých fosforylových skupin atd.) denaturace DNA je rozrušení dvouřetězcové struktury (např. teplotou) na jednotlivé komplementární řetězce renaturace DNA je opětné vytvoření dvoušroubovicové struktury z jednotlivých komplementárních řetězců

A, B a Z konformace DNA A B Z B forma - pravotočivá, standardní přirozená konformace A forma - pravotočivá, konformace arteficielní krystalické struktury s redukovaným obsahem vody Z forma - levotočivá, konformace vyskytující se občas uprostřed molekuly s B konformací A B Z A B Z

RNA

Mesengerová (informační) RNA – mRNA přenos informace z genu (DNA) do místa proteosynthesy veliká variabilita jak ve velikosti molekuly, tak stabilitě Přepis mRNA do sekvence aminokyselin proteinu začíná od 5´-konce většina mRNA obsahuje na 3´-konci polyA (20-250 adenylátových zbytků)

5´-konec „čapkován“ (capped)

Transferová RNA – tRNA malé molekuly (73 - 95 nukleotidů) 7-15% posttranskripčně modifikovaných bází.  3' konec vždy končí sekvencí CCA překlad informace ze sekvence mRNA do sekvence aminokyselin každá aminokyselina má alespoň jednu vlastní specifickou tRNA sekundární struktura připomíná jetelový trojlístek

Biosynthesa aminoacyl-tRNA tRNA je spojena s příslušnou aminokyselinou kovalentní esterovou vazbou na 3' konci katalysa enzymy aminoacyl-tRNA synthetasami 20 různých aminoacyl-tRNA synthetas, každá pro jednu aminokyselinu

Ribosomální RNA – rRNA většina buněčné RNA je rRNA jsou integrálními složkami ribosomů (5S , 5,8S , 28S a 18S) vykazuje katalytickou (enzymatickou) aktivitu při vytváření peptidické vazby

Malé interferující RNA Small interfering RNAs (siRNAs) okolo 22 nukleotidů zprostředkovávají nově objevený jev zvaný RNA interference (RNAi) významná role v regulaci genové exprese - váží se na specifické sekvence mRNA a takto označená specifická mRNA je rozložena enzymy zvanými endonukleazy

MikroRNA MicroRNAs (miRNAs) 22–24 nukleotidů odhaduje se , že je kolem 250 různých mikroRNA, ale je jich možná i 500 ovlivňují zásadním způsobem funkce zhruba 7 000 lidských genů regulace genové exprese - vazba na mRNA způsobí vyřazení příslušné mRNA z translace na příslušný protein

Genové utlumení (gene silencing) mikroRNA a malými interferujícími RNA Nature Rev Genet 3(2002) 737–747

Malé RNA jadérek Small nucleolar RNAs (snoRNAs) důležité pro biosyntézu rRNA modifikuje ribosomální RNA (rRNA) uspořádáním štěpení dlouhé pre-rRNA na funkční podjednotky (18S, 5,8S a 28S molekuly)

Malé jaderné RNA Small nuclear RNAs (snRNAs) součástí buněčné struktury (spliceosome) pro produkci mRNA odstraní nekodující oblasti (introny) genů a složí dohromady kodující regiony (exony) do mRNA sekvence kodující proteiny některé snRNA přitom v těchto reakcích vykazují znaky funkčního enzymu

Ribozym RNA molekula, která katalyzuje chemickou reakci název znikl spojením ribonukleová kyselina enzym ribozymy často katalyzují buď hydrolyzu jedné z vlastních fosfodiesterových vazeb nebo hydrolyzu vazeb v jiné RNA,

Rozdíly mezi DNA a RNA DNA RNA cukr deoxyribosa ribosa pyrimidinová b. thymin uracil struktura dvoušroubovice jeden řetězec alkalické prostř. stabilní labilní

Stanovení nukleových kyselin stanovení basí (UV) stanovení pentosy stanovení nativních řetězců (interkalující barvičky) – Hoechst 32 258, ethidium bromid obsah fosforu

Interkalace ethidium bromidu

Mutagenese přírodní nebo umělý proces měnící genetickou informaci organismu (DNA ev. RNA v retrovirech) proces je buď fysikální nebo chemické nebo biologické povahy UV světlo a ionisující záření jsou typické fysikální mutagenní agens

Mutagenese Vznik pyrimidinových dimerů UV světlem vznik dimerů vlivem UV je fotochemická reakce působí ihibici a špatné přepisování informace v DNA DNA reparační (opravné) mechanismy dokáží jednak rozštěpit thyminový dimer na původní thyminy, jednak „vystřihnou“ vadnou část řerězce a podle druhého řetězce (templátu) ji znovu správně nasynthetisují

Chemické mutageny – 1 Alkylační činidla N-Nitroso-N-ethylmočovina N-Nitroso-N-methylmočovina G....C 7-Met-G...T

Chemické mutageny – 1 Prokřižující alkylační agens hořčičný plyn (yperit) a dusíkatý yperit jsou nespecifická DNA prokřižující alkylační činidla bis(2-chloroethyl)methylamin

Chemické mutageny – 2 Deaminace Deaminace HNO2 Adenin Hypoxanthin Komplementární dvojice : A...T Hx...C C...G U...A

Chemické mutageny – 3 Analogy nukleobází Bromouracil (5-BrU) 5-BrU existuje v třech tautomerních formách, které se odlišně párují. Keto forma je komplementární k adeninu a jako taková bude inkorporována do DNA jako část páru tvořící vodíkové můstky s adeninem druhého řetězce během DNA replikace. Enol forma a ionizovaná forma jsou ale komplementární ke guaninu.

Chemické mutageny – 4 Interkalační agens např. Ethidium bromid nebo akridinová oranž po navázání mezi vlákna DNA způsobují inserci či deleci celého páru bází