Určování struktury krystalů Malé molekuly Velké molekuly Měřená intenzita (bez korekčních faktorů) Polohové vektory atomů ???? Atomové rozptylové faktory

Fázový problém Strukturní faktor Experimentální veličiny Elektronová hustota r Fázový problém

Monokrystalová strukturní analýza Příprava krystalů vhodných k difrakčnímu měření Sběr difrakčních dat Řešení fázového problému Upřesnění struktury Malé vzorky (~ 0.1 mm), nejlépe kulový tvar Biologické vzorky - v mateřském roztoku, molekuly solvátu (30-70 %) Mezní rozlišení atomů - Rmin = 0.92 dmin qmax= 25° pro Mo Ka Omezení pro makromolekuly

Určení symetrie krystalové struktury Bijvoetovy páry Centrosymetrický krystal Necentrosymetrický krystal Friedelův zákon Intenzita závisí pouze na velikosti strukturních faktorů Vážená reciproká mříž každého krystalu je centrosymetrická Difrakční obraz je vždy centrosymetrický

Centrosymetrický krystal Intenzita difraktovaných svazků závisí pouze na velikosti strukturních faktorů a nezávisí na jejich fázi Anomální disperze Centrosymetrický krystal Necentrosymetrický krystal

Laueova grupa symetrie 10 možných typů lauegramů Lze určit pouze makroskopické prvky symetrie

Vyhasínání reflexí Subtranslace - šroubové osy centrování mříže skluzové roviny centrování mříže (x,y,z)  Př. 21 podél c Pro 00l Pro l liché, F00l = 0 Šroubové osy se projevují vyhasínáním – h00, 0k0, 00l, hh0 Skluzové roviny se projevují vyhasínáním – 0kl, h0l, hhl, hk0

Urcčení typu mříže a přítomnost šroubových os nebo skluzových rovin Vyhasínání vlivem centrování buňky Možné difrakce Typ mříže h + k + l = 2n I h + k = 2n C h + l = 2n B l + k = 2n A h + k = 2n h + l = 2n l + k = 2n F -h + k + l = 3n R Urcčení typu mříže a přítomnost šroubových os nebo skluzových rovin Obecné a speciální vyhasínací podmínky

122 symbolů Difrakční symboly Laueho grupy symetrie Typu mříže Renningerův jev – vícenásobná difrakce Komplikace při hledání prvků symetrïe Určení Difrakční symboly Laueho grupy symetrie Typu mříže Přítomnosti šroubových os a skluzových rovin 122 symbolů mmmI--- mmmI-a- mmmIbca

Daný atom nepřispívá k pozorované intenzitě

Metody řešení struktur Iterativní metody - struktury určené symetrií krystalu jednoparametrové struktury Př. CsCl, NaCl, KCl, U [Valvoda, str. 292] CsCl Jedna vzorcová jednotka na buňku Primitivní buňka Difrakční symbol m-3P--- nebo m-3mP--- P23, Pm-3, P432, P-43m, Pm-3m Ekvivalentní polohy 1a: 0 0 0, 1b: ½ ½ ½ Pattersonovské metody Přímé metody

Pattersonovské metody Pattersonova funkce Maxima odpovídají všem možným meziatomovým vektorům spojujícím atomy v elementární buňce. Tato maxima mají stejnou periodicitu a symetrii jako krystalová mřížka. Výška píku je úměrná součinu protonových čísel atomů spojených vektorem u vynásobeném multiplicitou tohoto vektoru (N2 maxim)

Výrazná maxima v Pattersonově funkci 1. Řada vektorů se stejnou délkou a směrem 2. Limitovaný počet těžkých atomů s protonovým číslem výrazně větším než zbývající atomy těžký atom – těžký atom – výrazné maximum na mapě těžký atom – lehký atom – střední maximum na mapě lehký atom – lehký atom – výrazné maximum na mapě Vždy centrosymetrická funkce zachovává centraci prvky symetrie s translační složkou jsou nahrazeny prvky bez této složky Použití projekcí Pattersonovy funkce Harkerovy řezy a přímky Nakupení maxim (od atomů spjatých operacemi symetrie)

Pětiatomová molekula Všechny možné meziatomové vektory Maxima elektronové hustoty Pattersonova mapa Pattersonova funkce

Rozdělení elektronové hustoty Fourierova řada periodicita

Fourierova syntéza, mapy elektronové hustoty Translační perioda Dvojrozměrné řezy Projekce vážené reciproké mříže do roviny l = 0 Projekce

Metoda těžkého atomu Polohy těžkých atomů známé (např. z Pattersonovy funkce) n těžkých atomů Postupná Fourierova syntéza se startovacím souborem FH o stejných znaménkách jako FHT. Rozptyl na těžkých atomech dominuje a určuje znaménka většiny strukturních faktorů

Příklad m1/m2 = 3/8 -25/60 -17/60 -12/60 -4/60 4/60 12/60 17/60 25/60 f1 ~ 3·(-2 sin2q/l2) f2 ~ 8·(-2 sin2q/l2) h F(h) FT(h) 34 16 1 4 5 2 -11 -10 3 -7 -13 11 14 6 -6 7 -9 8 -16 9 -4

Pattersonova funkce xT = 0,196 ~ 12/60 Fourierova syntéza se znaménky určenými z poloh těžkých atomů Fourierova syntéza se znaménky určenými z poloh těžkých atomů a vynecháním nejistě určených faktorů Fourierova syntéza se správnými znaménky Fourierova syntéza s váženými koeficienty

Substituční metody MIR - Multiple Isomorphous Replacement SIR- Single Isomorphous Replacement SIRAS - Single Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering Příprava derivátů. Nahrazení několika atomů ve známých polohách jinými atomy (např. lehkých atomů těžkými) Hlavní užití – při studiu makromolekul

Příklad pro centrosymetrický krystal: Izomorfní deriváty A, B Příklad pro centrosymetrický krystal: Faktory symetrie známé Př. Následná Fourierova syntéza

Metoda anomální disperze MAD - Multi-wavelength Anomalous Diffraction Centrosymetrický krystal změřené hodnoty FH je pro centrosymetrický krystal reálná veličina l v blízkosti absorpční hrany těžkého atomu

Jednotkové strukturní Přímé metody Statistické metody, využití obecných informací o elektronové hustotě, nerovností Cauchy Střed symetrie Jednotkové strukturní faktory

Centrosymetrický krystal Součet N/2 nezávislých náhodných veličin se střední hodnotou Náhodné rozdělení souřadnic Rozptyl Distribuční funkce F

Necentrosymetrický krystal Celková pravděpodobnost, že A leží mezi A a A+dA a B mezi B a B+dB je P(A).P(B)

Elektronová hustota musí být nezáporná a soustředěná do Pro střed symetrie Dvojčetná osa ve směru c Rovina zrcadlení kolmá k ose c Karle, Hauptman Elektronová hustota musí být nezáporná a soustředěná do konečného počtu diskrétních atomů

Rozptyl na bodovém nekmitajícím atomu, úhlově nezávislý Normalizované strukturní faktory Počet identických příspěvků k FH od symetricky ekvivalentních atomů N... Počet atomů v základní buňce Atomové číslo Rozptyl na bodovém nekmitajícím atomu, úhlově nezávislý Strukturní invarianty Mapa s ostrými maximy Fáze obecně závisí na volbě počátku buňky Součet fází fh1¡+ fh2+ fh3 je strukturní invariant (nezávislý na volbě počátku mříže), pokud h1 + h2 + h3 = 0 (součet tří difrakčních vektorů je nulový)

H = K + (H - K) obecně H1 + H2 + … + Hn = 0 Strukturní invarianty Triplety, kvartety, F000 H = K + (H - K)

Elektronové hustoty jsou nezáporné Pro podobné sin q/l > 0 > 0 > 0 Pro velká |F| > 0 Součet kladných a záporných hodnot malé číslo Pro velké strukturní amplitudy

Centrosymetrické krystaly Sayreho rovnice Pro silné reflexe k a h - k, určuje součin těchto reflexí v Sayreho vztahu znaménko Pravděpodobnost, že určené znaménko je kladné Čím větší jsou hodnoty Eh, Ek, Eh-k, tím větší je pravděpodobnost správného určení znaménka

Necentrosymetrické krystaly Nejpravděpodobnější hodnota strukturního invariantu je rovna nule Tangentová formule Střední hodnota pro různá K Nejpravděpodobnější hodnota H S variancí správné hodnoty fáze H  

Postup při určování struktury Sběr dat Orientační matice O Vztah mezi souřadným systémem krystalu (C) (goniometrické hlavičky) a systémem reciproké mříže* Souřadnice vektoru h popisujícího nějakou veličinu v reciprokém prostoru systém krystalu laboratorní systém reciproký systém Pro určení orientační matice stačí znalost přesných hodnot Millerových indexů a reciprokých souřadnic pro tři nekoplanární difrakční vektory

„Peak hunting“ – orientační reflexe, ve středu Braggových úhlů Indexace píků Volba vhodné počáteční reciproké buňky Tři nejkratší nezávislé vektory vybrané z tabulky difrakčních vektorů a rozdílů difrakčních vektorů, pomocí nichž se podaří přiřadit Millerovy indexy všem vstupním orientačním reflexím Indexace v přímém prostoru Koncové body libovolných nezávislých uzlových vektorů v reciprokém prostoru definují rovinu, jejíž normála splývá s nějakým vektorem v přímém prostoru Projekce všech uzlových bodů reciprokého prostoru do směru vektoru odpovídajícího přímého prostoru tvoří jednodimenzionální mřížku. Upřesňování orientační matice Počet orientačních reflexí minimalizace

Měření integrálních intenzit w sken w-2q sken

Rotační metoda Vhodná pro velké buňky (velké množství reflexí) Krystal rotuje nebo osciluje kolem osy kolmé na dopadající paprsek Difrakční podmínka je splněna pro úseky rovin v reciprokém prostoru, které mají nenulový průnik s lunetami vymezenými Ewaldovými koulemi odpovídajícími krajním polohám. Reflexe obsažené v každém z párů lunet mají společný jeden z indexů Zakázaná oblast Nutnost více os

Monokrystalový difraktometr s plošným detektorem Rmax = l/2 sin qmax Rmin = l/2 sin qmin 2qmax = qc + tan-1(a/2D) 2qmin = qc - tan-1(a/2D)

Korekce na Lorentzův faktor a polarizaci Korekce na absorpci Transmisní koeficient T Analytické korekce: Koule, válec, čtyřstěn Dráhy dopadajícího a difraktovaného svazku Empirické korekce Hmotový absorpční koeficient Hmotnostní frakce

Postup při určování struktury Měřené intenzity korigované na Lp faktor, případně absorpční faktor, určení škály Hodnoty atomových faktorů pro s = <s2>-(1/2) Statistická analýza v souboru reflexí Hodnoty strukturních faktorů přibližně korigované na vliv teplotních kmitů Výpočet normalizovaných strukturních faktorů

Iterativní určování fází Roztřídění reflexí do skupin podle kombinací sudých a lichých indexů Setřídění podle hodnot normalizovaných strukturních faktorů Výběr tří vhodných skupin a v nich max. |Eh| Přiřazení fází těmto hodnotám Výběr dalších reflexí s velkými |Eh| a přiřazení symbolických fází Startovací soubor reflexí Fourierova syntéza s koeficienty Eh

Schema určování fází přímými metodami Normalizace |Fobs| Nalezení strukturních invariantů Volba optimální počáteční množiny fází Výpočet fází strukturních faktorů Eobs Test fází Výpočet Fourierovy mapy Interpretace Fourierovy mapy

Upřesňování struktury V přímém nebo v reciprokém prostoru Modelová struktura Upřesněná struktura

Elektronová hustota azidopurinu Rozlišení 0,55 nm – 7 reflexí 0,25 nm – 27 reflexí 0,15 nm - 71 reflexí 0,08 nm – 264 reflexí

Elektronová hustota spočtená Rozdílová Fourierova syntéza Elektronová hustota spočtená bez neznámých poloh

Upřesňování v reciprokém prostoru monokrystal polykrystal Porovnávání spočtených a naměřených strukturních faktorů Metoda nejmenších čtverců Simulované žíhání Genetický algoritmus Faktor spolehlivosti

Problémy v makromolekulární strukturní analýze Velký počet určovaných parametrů Šum Hledání minima E = Echem + Rw Empirické informace o rovnovážné kovalentní vazebné geometrii, o molekulových vibracích, vodíkových můstcích a nevazebných interakcích