Průmyslová toxikologie (C867) Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita Průmyslová toxikologie (C867)

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Testovací metody LLNA – Local Lymph Node Assay (Test regionálních mízních uzlin) - OECD 429 GMPT - Maximalizační test na morčatech - OECD 406

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 Vyvolání alergické reakce vyžaduje aktivaci a následnou expanzi T-lymfocytů Střet kůže se senzibilizátorem vyvolá transport antigenů z kůže do lymfatických uzlin Antigenem řízená aktivace T-lymfocytů má za následek dělení a diferenciaci alergen-specifických T-lymfocytů Nárůst počtu T-lymfocytů je měřitelným ukazatelem reakce organismu na kontakt s látkou mající senzibilizační potenciále

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 Pokusná zvířata – samice myší staré 8 – 12 týdnů, kmen BALB/c, NMRI Postup testovaná látka – 3 různé koncentrace negativní kontrola – aceton/olivový olej, dimethysulfoxid aj. pozitivní kontrola - dinitrochlorbenzen aj.

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 DEN 1 – 3 aplikace test. látky na dorsální stranu obou uší , aplikační objem 25 mL na ucho DEN 6 aplikace fyziologického roztoku obsahujícího předepsané množství radionuklidu (3H thymidin nebo 125I deoxyuridin) 5 hodin po aplikaci utracení zvířat a odběr uzlin

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 Vyhodnocení Příprava buněčné suspenze Měření inkorporované aktivity v dpm Výpočet Indexu stimulace: průměrná hodnota dpm exponované skupiny/ průměrná hodnota dpm kontrolní skupiny je-li IS větší nebo roven 3 je látka považována za senzibilizující. dávková závislost

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) GMPT - OECD 406 Indukční fáze: kontaktem kůže se senzibilizátorem jsou aktivovány T-lymfocyty a dochází k jejich proliferaci (jako u testu LLNA) Provokační fáze: opakovaným kontaktem se senzibilizátorem je u zvířete vyvolána alergická reakce – kontaktní dermatitida Pokusná zvířata: albinotická morčata obou pohlaví, váha 150 – 250 g, kmen BFC, ve studii 30 zvířat (20 exponovaných + 10 kontrolních)

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) GMPT - OECD 406 Metodika: DEN 1 - indukční expozice intradermální DEN 7 - lokální indukce dermální DEN 21 - provokace DEN 23 a 24 – odečet kožní reakce Vyhodnocení: 24 a 48 hodin po aplikaci se vyhodnotí kožní reakce (zarudnutí, otok) Porovnává se reakce kůže exponované testovanou látkou a reakce kůže exponované vehikulem Pozitivní výsledek = 30% morčat má pozitivní reakci na kůži tj. zarudnutí případně otok

Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Porovnání GPMT a LLNA testu GMPT : Manipulace: holení, injekční aplikace, opakovaná bandáž Test trvá 25 dní Výsledek = subjektivní hodnocení LLNA: Manipulace: přímá aplikace test. látky neinvazivní formou Test trvá 6 dnů Výsledek = číslo U některých látek nelze použít

Genotoxicita Rozdělení mutací Studie poskytují informace o možných genotoxických vlastnostech látek tj. o schopnosti způsobovat změny genetického materiálu - mutace Rozdělení mutací genové - změny v molekule DNA chromozomální - chromozomální aberace (změny struktury a tvaru chromozómu) genomové - změny v chromozomálním počtu nechromozomální - mimojaderné

Genotoxicita - testovací metody Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo Mutagenita in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech Mutagenita-test reverzních mutací u baktérií Genové mutace-Saccharomyces cerevisiae Mitotické rekombinace Saccharomyces cerevisiae Mutagenita-test genových mutací v savčích buňkách in vitro Poškození DNA reparace- neplánovaná syntéza DNA-savčí buňky in vitro SCE - výměna sesterských chromatid in vitro Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophilla melanogaster Test transformace savčích buněk in vitro Dominantní letální test u hlodavců

Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií – OECD 471 Detekce genových mutací – mutace v genu pro syntézu aminokyselin His (Trp) zkouška pro počáteční vyšetření genotoxické aktivity pět kmenů bakterií je vystaveno působení zkoušené látky za přítomnosti i bez přítomnosti metabolického aktivačního systému aktivační systém – posmitochondrionální frakce z jater hlodavců ošetřených prostředkem indukujícím enzymy Kontrola počtu narostlých kolonií po 48-72 hod – porovnání počtu kolonií revertantů (v přítomnosti testované látky) s počtem kolonií spontánních revertantů (NK)

Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Identifikace látek způsobující strukturní chromozomové aberace = změny ve struktuře nebo počtu chromozomů zjištění možných mutagenů a karcinogenů u savců Základní rozdělení aberací: Chromatidového typu Chromozomového typu Pro test se používají stabilizované buněčné linie, buněčné kmeny nebo primární buněčné kultury

Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Kultury jsou vystaveny zkoušené látce (a to s metabolickou aktivací i bez ní), v předem stanovených intervalech se přidává látka zastavující metafázi (např. Kolchicin) Hodnocení přítomnosti chromozomových aberací - nejméně 200 mitóz (46±2 centromery) Stanoven Mitotický index - buňky v metafázi : celkový počet buněk v populaci Procento aberentních buněk vůči negativní kontrole

Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Chromozomové aberace - příklady Chromozomový zlom Prstencový chromozom (kruhový fragment)

Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Chromozomové aberace - příklady Acentrický fragment Dicentrický chromozom

Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 Mikronukleus test zjišťuje poškození, jež testovaná látka způsobuje v chromozómech nebo mitotickém aparátu erytroblastů. Výsledkem cytogenetického poškození je vznik mikrojader – chromozómových fragmentů v erytrocytech a současně změna v poměru zralých a nezralých erytrocytů v kostní dřeni. Pro tento test existuje in vitro metoda – v současné době je ve fázi schvalování Metodika in vivo – pokusné zvíře potkan testovaná látka v 1 – 3 koncentracích negativní kontrola + pozitivní kontrola jednorázová aplikace vyšetření kostní dřeně 24 a 48 hodin po aplikaci

Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 Hodnocení kostní dřeně Normochromní erytrocyt: zralý erytrocyt, barvící se eosinofilně – červenooranžově Polychromní erytrocyt: nezralý erytrocyt, barvící se bazofilně - šedomodře Mikrojádra: fragmenty jádra vznikající během dělení buňky z chromozómů opožděných v dělení Hodnocení poměr zralých a nezralých erytrocytů přítomnost nezralých erytrocytů s mikrojádry

Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 savčí buňky s mikrojádry – in vitro test - příklady

Mutagenita – kometový test (Comet assay)