Imunoglobuliny – struktura Imunoglobuliny – funkce Genetický základ tvorby imunoglobulinů Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů I. (IgG, IgA) Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů II. (IgM, IgD, IgE) Izotypový přesmyk. Idiotypy a antiidiotypy - význam. Imunologická paměť Ontogeneze imunitní odpovědi Primární imunitní odpověď Sekundární imunitní odpověď. Efektorové funkce protilátek Simona Kaftanová

Struktura imunoglobulinů 4 polypeptidové řetězce: 2 identické těžké (H) 2 identické lehké (L) H řetězce: μ, δ, γ, α, ε (rozdíly ve složení AK) L řetězce: κ, λ Izotypy = třídy Igg: IgM (μ) IgD (δ) IgG (γ) IgA (α) IgE (ε)  

Struktura Ig - členění Dle štěpení enzymem papainem: Fab-fragmenty – obsahují vazebné místo pro Ag Fc-fragment - reaguje s Fc-receptory na buňkách těla Domény („oblasti“) na H i L řetězci: variabilní (V) - formuje rozpoznávací část pro Ag konstantní (C) - určuje sekundární biologické funkce Ig

Struktura Ig – vazebné místo pro Ag hypervariabilní úsek VL VH Paratop - vazebné místo pro Ag; reaguje specificky s epitopem Ag = oblast Ig tvořená hypervariabilními oblastmi VH a VL (hypervariabilní oblast – „špička“ variabilní oblasti s vysoce variabilním složením sekvencí AMK; určuje strukturu/specifitu vazebného místa pro Ag na základě složení sekvencí AMK, ale i morfologie a tvaru oblasti) Idiotop - jednotlivé unikátní struktury variabilní oblasti daného Ig (Ab); některé idiotopy mohou být totožné s vazebným místem pro antigen, jiné leží mimo paratop Idiotyp - suma všech idiotopů jedné Ig molekuly; společný identickým Ig molekulám

Antiidiotypové protilátky tzv. protilátky 2. generace (idiotyp protilátek I. generace se chová jako antigen, tj. mohou proti němu vznikat Abb - antiidiotypové) tvoří vnitřní obraz antigenu (některé antiidiotypové Abb mají vazebné místo, které se alespoň částečně podobá epitopu Ag, který vyvolal tvorbu Abb I. generace) vyvolávají další tvorbu Abb proti sobě samým → antiantiidiotypové protilátky (protilátky 3. generace)→ vzniká idiotypová síť regulační fce  

Funkce Igg obecně: protilátky – Igg sekretované (solubilní) antigenní receptor (BCR) - membránové Igg (IgM a IgD na povrchu B lymfo) biologické vlastnosti jednotlivých izotypů Igg dány odlišnostmi v H-řetězcích resp. jejich konstantní částí resp. Fc-fragmentem: při vazbě v IK váže C1 → aktivuje komplement (klasická cesta) reaguje s Fc-receptory na buňkách těla určuje sekundární biologické aktivity izotypů Ig (př. biologický poločas, distribuci v těle a přechod přes placentu, schopnost opsonizace bakt., vazba IgE na mastocyty apod.)

sérum, intersticiální tekutina opsonizace (hlavní opsonizující Ig) Izotyp Obsah v séru dospěl.(g/l) Biolog. poločas Tělesné tekutiny Funkce IgG (podtřídy IgG1-4 ) -monomer 8-18 21 dnů sérum, intersticiální tekutina opsonizace (hlavní opsonizující Ig) neutralizace aktivace komplementu (klasic.) přestup placentou (jediný Ig) sekundární protilátková reakce (hlavní protilátka) IgA - sérový - slizniční (dimer + sekreční komponenta) 0,9-3,5 6 dnů sérum, slzy, sliny, povrch sliznic a jejich sekrety, mléko, pot ochrana sliznic (neutralizace) opsonizace IgM - pentamer - monomer (BCR) 0,9-2,5 sérum, membrána B lymfo aktivace komplementu (klasic.) primární protilátkové reakce (první a hlavní protilátka) při intrauterinní infekci produkovaná plodem receptor pro Ag (BCR) IgD 0,1 3 dny IgE 3x10-4 2 dny sérum, interstic.t., povrch mastocytů a bazofilů ochrana proti parazitům atopická reakce

Genetické základy tvorby imunoglobulinů Geny pro H-řetězec (14. chromozóm) geny se člení do sekvenčních oblastí V, D, J, C (mezi nimi jsou dlouhé nekódující sekvence) V (několik set – zajišťují variabilitu) D (cca 50) J (9) C (kódují izotypy Ig - Cμ, Cγ, Cα, Cδ, Cε) Geny pro L-řetězec (κ - 2. chromozom, λ - 22. chromozom) struktura jednodušší – V, J, C

Proces rekombinace těžkého řetězce: a) nejprve tzv. D-J přeskupení částí genu, čímž se spojí náhodně určitý úsek D s některým úsekem J b) vyštěpení úseku mezi některým V a D-J; dochází k tzv. V-D přeskupení c) pokud vzniklý V-D-J produkt vyhovuje (= „dá se přečíst“), dojde k transkripci do mRNA a sestřihu (k VDJ se připojí C sekvence pro sestavování AMK pro daný Ig)   d) translace v protein, jehož struktura je kódována sekvencemi V, D, J, C

Proces rekombinace lehkého řetězce:

Tvorba Ig molekuly

Izotypový přesmyk v průběhu imunitní odpovědi na Ag dochází u plazmocytů k přesmyku od tvorby IgM k produkci IgG nebo jiných tříd Ig mechanismus: segment Cμ je vyštěpen a na jeho místo se dostane v pořadí další segment př. Cγ (produkce protilátek IgG) směr přesmyku (volbu izotypu) regulují cytokiny - hlavně IL-4 (stimuluje produkci IgG1, IgE), TGF-β, IL-10 ... změna se týká konstantní domény H-řetězc; antigenní specifita je zachována  

K velké diverzitě protilátek přispívají hlavně: různost kombinací genových segmentů a následný sestřih nepřesné spojování V, D a J a připojení náhodných segmentů somatické mutace = mutace genů variabilní oblasti až po přeskupení a to v okamžiku setkání zralého B lymfocytu s Ag v lymfoidních foliklech (ponechány jsou mutanty s vysokou afinitou k Ag)  

Imunitní reakce založené na protilátkách a) Primární imunitní odpověď (protilátková reakce při primární infekci): probíhá ve dvou navazujících fázích – primární a sekundární charakteristický vznik paměťových bb. a vysokoafinních Abb v procesu tzv. afinitní maturace b) Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí):

Primární imunitní odpověď – primární fáze: první setkání B lymfo s Ag v sekund. lymf. org. → …viz Th2 reakce… vznik klonu mnoha dceřiných B lymfo s identickou nebo velmi podobnou specifitou → jejich diferenciace v plazmatické bb. (část B buněk se mění v paměťové bb.) část plazmatických bb. zpět do oběhu (do kostní dřeně aj. v organismu) za 3-4 dny od imunizace (primární infekce) plazmatické bb. vyprodukují množství Abb. první se tvoří IgM s nízkou afinitou k Ag → účinné při blokování šíření infekce IgM tvoří s Ag imunokomplexy (IK) → zachycovány v sekund. lymf. org. na povrchu tzv. folikulárních dendritických bb. (FDC) → IK mohou být skladovány na povrchu FDC či odstraňovány fagocytózou   Výjimka: T-nezávislé Ag (hl. bakteriální polysacharidy) vyvolávají diferenciaci B lymfo na plazmatické bb. bez spolupráce s Th, př. aktivují B lymfo nespecificky tím, že se váží na receptory pro LPS, tj. nezávisle na specifitě)

Primární imunitní odpověď – sekundární fáze: a) změna afinity: Agg skladované v IK na FDC jsou rozeznávány B lymfo → další dělení a diferenciaci B lymfo (spolupráce Th2) → mutace genů pro variabilní oblast Igg → vzniklé klony mají odlišná vazebná místa BCR a produkovaných Abb. než B lymfo z primární fáze → v soutěži o snižující se množství Ag uspějí B lymfo s nejvyšší afinitou k Ag (ostatní B bb. hynou) = proces afinitní maturace → vede ke vzniku Abb s několikanásobně vyšší afinitou než IgM z primární reakce („kvalitnější“ Abb)   b) izotypový přesmyk (viz Genetika Igg): záměna těžkého řetězce μ (nevratné vyštěpení genové sekvence) původního IgM za jiný a následná tvorba odpovídajícího izotypu (IgG – druhý v pořadí nebo IgA, IgE, IgD) pod vlivem cytokinů (př. IL-4) za současného přímého kontaktu aktivovaných T lymfo s B lymfo (prostřednictvím adhezivní a kostimulační molekuly CD40/CD40L) Pozn. po primární infekci dlouhou dobu přetrvává hladina Abb, které jsou schopné zabránit novému vzniku té samé infekce hned v počátku.

Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí): rychlá aktivace paměťových bb. vzniklých při primární odpovědi → další zvýšení afinity Abb, počtu Abb a změny v izotypovém složení (IgG dosahuje dříve vyšší hodnoty) potlačení infekce je rychlejší a účinnější

Imunologická paměť – část populace T a B-ly se po prvním setkání s Ag mění na paměťové buňky; jsou připraveny pro sekundární (anamnestická) odpověď, kdy jsou rychle aktivovány (vylepšují se vazebné schopnosti Abb k Ag – afinitu; rychlejší izotypový přesmyk)

Efektorové mechanismy působení protilátek: neutralizace – Abb blokují aktivitu toxinů, virů a jiných mikroorg. tím, že se váží na kritické epitopy nutné pro toxické působení inhibice adherence patogenů na buněčné povrchy – Abb navázané na patogen blokují jeho přichycení na slizniční povrchy (hl. fce sIgA) opsonizace – Abb navázané na Ag částici zlepšují či umožňují pohlcení této částice fagocyty či její napadení NK bb. (viz ADCC) ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) – NK bb. mají receptor FcR pro IgG; je-li Ag opsonizován IgG a dojde k navázání Fc-IgG na FcR NK b., aktivuje se degranulace NK b. na Ag   vazba Ab-Ag aktivuje komplement klasickou cestou → produkty komplementu přispívají k opsonizaci, chemotaxi fygocytů a rozvoji zánětlivé rce, k osmotické lýze cílových buněk

Ontogeneze imunitní odpovědi a/ prenatální vývoj krvetvorba extraembryonální začíná ve 2.-3.týdnu gestace → postupně se krvetvorným orgánem stávají játra (celé intrauterinní období) → částečně se zapojuje i slezina → hlavní úlohu hematopoezy přejímá kostní dřeň (pokračuje postnatálně) T-buňky - prekurzory postupují do thymu → diferenciaci do lymfoidních bb., selekce. B-buňky – syntéza specifických IgM již intrauterině, ale koncentrace prakticky neměřitelná (měřitelné konc. IgM při porodu = známka intrauterinní infekce) x IgG se začínají tvořit až po porodu. zralé monocyty-makrofágy, neutrofily již ve fetální cirkulaci; neutrofily v menším počtu

Ontogeneze imunitní odpovědi b/ postnatální vývoj B lymfo: po narození reakce na Ag podněty - hl. tvorba IgM (konc. srovnatelná s dospělými v 1.- 3.r.) tvorba IgG pozvolná a současně mizí mateřské IgG (největší pokles mezi 3. - 6. měs. → vyšší nemocnost) (konc. srovnatelná s dosp. mezi 10.-15.r. ) protilátková reakce na polysacharidové antigeny (př. haemophilus) se objevuje až kolem 2. roku T lymfo : po narození převážně naivní; nižší aktivita Tc, nižší funkce Th se normalizuje do 1 roku vzestup Th1-reaktivity kulminuje na začátku dospělosti (zvýšený výskyt AI onem.)   nespecifická imunita novorozenců – funkčně méně zdatná

Ontogeneze imunitní odpovědi c/ stáří snížená cytotoxicita NK-buněk a makrofágů přesmyk od Th1 k Th2 snížená protivirová a protinádorová imunita nižší protilátková odpověď na nové podněty vyšší produkce autoprotilátek

Monoklonální protilátky (mAbb) Abb produkované jedním určitým klonem plazmatických bb. (bb. odvozené od jednoho B lymfo) identické molekuly (Abb jednoho izotypu a jedné specifity - variabilní část namířena jen proti jedné specifické části daného Ag)   XXX Polyklonální protilátky (konvenční) „směs“ monoklonálních protilátek Abb namířené proti různým epitopům daného Ag získávají se obvykle imunizací zvířat – tzv. antiséra

Monoklonální protilátky (mAbb)  Výskyt: a) nádor z plazmatických bb. (mnohočetný myelom, plazmocytom) b) produkt hybridonu (= in vitro výroba)   Hybridon = b. získaná fúzí b. myelomu a slezinného lymfocytu myši imunizované příslušným Ag: nádorová b. dodává hybridonu nesmrtelnost a schopnost produkce Abb jednoho izotypu lymfocyt dodává specifitu vůči určitému Ag → spojením těchto bb. vzniknou kultivované hybridomy schopné uvolňovat mAbb do kultivačního media Využití: mAbb označené enzymy a fluorescenčními látkami atd. (= konjugát) → využití v labo dg., tp. pozn. humanizované monoklon. Abb - metodou genetického inženýrství se zmodifikují molekuly tak, že z myší pocházejí jen vazebná místa, kdežto ostatní části protilátkové molekuly jsou kódované z lidských genů

Příprava monoklonálních Abb (mAbb) slezinné lymfo z myši imunizované příslušným Ag buňky myelomu fúze myelomových bb. a slezinných lymfo selekce hybridomů a jejich další kultivace klonování hybridomů výběr vhodných hybridních klonů tvořících jen tu žádanou mAb

Příprava polyklonálních Abb