Kampylobaktery v potravním řetězci Iva Steinhauserová Gabriela Bořilová Veterinární a farmaceutická univerzita Ústav hygieny a technologie masa Palackého 1-3 Brno, 612 42

KAMPYLOBAKTERIÓZA epidemiologicky významné alimentární onemocnění – zoonóza původce: termofilní druhy rodu Campylobacter – C. jejuni, C. coli kampylobakteriózy x salmonelózy rozvinuté země x rozvojové země Vzhled C. jejuni pod elektronovým mikroskopem

KAMPYLOBAKTERIÓZY VE SVĚTĚ

NÁRŮST KAMPYLOBAKTERIÓZ zlepšení diagnostických metod zkvalitnění zdravotnické dokumentace / administrativy nárůst konzumace drůbeže/drůbežích výrobků Produkce = vysoká efektivita výkrmu, vysoce prošlechtěná masá plemena Ekonomika = relativně nízká cena Společnost = přijatelné pro většinu skupin obyvatel, semivegetariáni, náboženské důvody Výživa = nízký obsah tuku, snadná stravitelnost, rychlá a snadná kulinární úprava, vysoká míra inovace nabízeného sortimentu (např. drůbež s prodlouženou dobou výkrmu, baby výrobky, apod.)

ZDROJE NÁKAZY kontaminované suroviny / potraviny kontaminovaná voda = syrové maso, syrové mléko, syrová zelenina = nedostatečně tepelně upravené maso (chybná kulinární úprava), mražené výrobky kontaminovaná voda = použití kontaminovaných povrchových nebo odpadních vod kontakt se zvířaty = zemědělská prvovýroba, domácí mazlíčci (pets)

VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP. caecum a colon hospodářských a volně žijících zvířat (většinou bez klinických příznaků) drůbež = vysoký výskyt = 0 – 92 % farem (0 – 100 % jedinců v hejnu) = C. jejuni, C. coli, C. fetus subsp. fetus, C. lari = různá prevalence u různých druhů drůbeže (brojleři, křepelky, krůty) = různá prevalence u stejných druhů drůbeže v různých zemích = vliv chovné technologie, věk zvířat, zoohygiena farem, logistika porážek

VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP. divocí ptáci = bažanti, vrabci, holubi, vrány,aj. prasata = 30 – 70 % (C. coli) hlodavci, hmyz pets (častý a těsný kontakt s lidmi (dětmi) skot = 10 – 30 % ovce = 10 – 30 %

KULTIVACE CAMPYLOBACTER SPP. ČSN EN ISO 102 72 (2006) Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Campylobacter spp. Pomnožení = bujon dle Boltona = při 37°C po dobu 4h = dále při 41,5°C po dobu 44h ±4h = mikroaerobně (GeneratingKit CAMPsystem) Izolace = mCCDA agar + druhá izolační půda (Karmali agar) = při 41,5°C po dobu 44h ±4h = mikroaerobně = charakteristické kolonie Vzhled Campylobacter spp. na Karmali

IDENTIFIKACE PCR / RFLP typizace termofilních Campylobacter – C. coli, C. jejuni, C. lari a C. upsaliensis = 491 bp: gen 23S rRNA = specifický pro termofilní Campylobacter spp. štěpení produktu restrikční endonukleázou AluI: identifikace C. jejuni a C. coli štěpení produktu RE Tsp509I = identifikace C. lari a C. upsaliensis)

PCR IDENTIFIKACE C. JEJUNI /C. COLI identifikace pomocí multiplex PCR 16S rRNA gen – 857 bp = Campylobacter spp. mapA gen – 589 bp = Campylobacter jejuni ceuE gen – 462 bp = Campylobacter coli Identifikace C. jejuni / C.coli pomocí mPCR M 1 2 3 4 5 857 bp 589 bp 462 bp 1 2 M 3 4 jejuni coli mix coli jejuni (M = marker, 1 = C. jejuni ATCC 33560 , 2= C. coli ATCC 43478 , 3 = mix, 4 = C. coli wild typ, 5 = C. jejuni wild typ)

REZISTENCE K ATB Agarová diluční metoda (CLSI M7 – A7) ATB : NAL = kyselina nalidixová, CIP = ciprofloxacin, TET = tetracyklin, ERY= erythromycin, CMP = chloramphenicol, AMP = ampicilin, GEN = gentamicin + ENR = enrofloxacin, KAN = kanamycin, STR = streptomycin inoculum: 48 h kultura, ředěna v BHI do 0.5 McF kultivace: Mueller - Hinton agar inkubace: 42ºC po dobu 48±2h, mikroaerobně (GeneratingKit CAMPsystem) vyhodnocení: CLSI M100 - S16 (2006) – Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Sixteenth Informational Supplement COMITE DE L’ANTIBIOGRAMME DE LA SOCIETE FRANCAISE DE MICROBIOLOGIE - Recommandations 2007

MECHANISMUS REZISTENCE sledování pomocí molekulárně-biologických metod – PCR, mPCR, PCR/RFLP, MAMA PCR REZISTENCE K MAKROLIDŮM PCR-RFLP + MAMA PCR detekce dvou bodových mutací (A2074C + A2075G) v genu 23S rRNA ERY RFLP detekce mutace A2059G – štěpení RE BsaI 320 bp M 1 2 3 4 M = marker 1, 2 , 3 , 4 = resistant strains C. coli REZISTENCE K TETRACYKLINŮM MULTIPLEX – PCR detekce tet genů tet(O), tet(M) + tet(A), tet(B) tet(E) TET REZISTENCE K CHINOLONŮM MAMA PCR detekce mutací v genu gyrA mutace na pozici Thr-86-Ile NAL, CIP, ENR

VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP. NA FARMÁCH BROJLERŮ V ČR 2005 + 2006 Campylobacter  spp. Campylobacter   jejuni Campylobacter  coli Farmy s intenzivní produkcí  vyšetřené farmy n 50 Campylobacter spp. pozitivní farmy 45 43 17 prevalence 90 % 86 % 34 % Farmy ekologické vyšetřené farmy 1 100 %

VÝSKYT A TYPIZACE CAMPYLOBACTER SPP. IZOLOVANÝCH Z BROJLERŮ Počet test. farem vzorků Vzorky Campylobacter spp. pozitivní C. jejuni C. coli Mix samples (C. jejuni + C. coli) n % 2005 21 594 448 75.42 400 89.29 44 9.82 4 0,89 2006 30 541 447 82.62 316 70.70 51 11.40 80 17.89 celkem 1135 895 78.85 716 80.00 95 10.61 84 9.39

VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP. U DRŮBEŽE VE VYBRANÝCH ZEMÍCH 2005 2004 2003 2002 2001 Rakousko 61.4 64.5 58.7 57.6 * Dánsko 29.9 19.4 32.4 38.8 Finsko 7.4 6.2 6.5 4.0 Německo 50.4 39.2 63.9 Itálie 86.3 91 71.4 87 Norsko 3.4 3.1 4.9 6.3 7.7 Švédsko 13.3 14.2 17.6 19.8 16.2 Francie 85.2 83.1

VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP VÝSKYT CAMPYLOBACTER SPP. NA FARMÁCH S RŮZNOU TECHNOLOGIÍ CHOVU BROJLERŮ V ITÁLII Typ chovu Vyšetřené farmy Camp. pozitivní farmy Odebrané vzorky Camp. pozitivní vzorky C. jejuni C. coli N % Intenzivní chovy 26 25 96.1 128 123 23.58 56.91 Extenzivní chovy 11 10 90.9 56 51 66.67 29.41 Ekologické chovy 7 100 35 48.57

FLA – RFLP SUBTYPIZACE C. JEJUNI amplifikace variabilní část genu pro flagellinA profily fragmentů po štěpení třemi RE: AfaI – 6 typů, MboI – 7 typů HaeIII – 5 typů kombinací typů štěpení dosud nalezeno 31 subtypů C. jejuni

PFGE SUBTYPIZACE C. JEJUNI pulsní gelová elektroforéza celého chromozomu štěpeného RE SmaI fragmenty děleny na CHEF-DR III systému (BioRad), 1% agaróza, 200 V, úhel 120o, 9oC; 5 -10 s, 4 h; 10 - 40 s, 14 h; 50 - 60 s, 4 h. dosud bylo nalezeno 32 PFGE subtypů b+b1, e+1+ e2 – příbuzné kmeny, * - C. coli

VÝSLEDKY SUBTYPIZACE chovy nejsou infikovány různými bakteriálními klony, kombinace výsledků obou analýz naznačují, že jednotlivá hejna byla kontaminována převážně identickými klony u kterých během kolonizace došlo k mutacím variabilitu subtypů lze vysvětlit především mutacemi v genu flaA (detekované PCR/RFLP) polymorfismy v oblastech štěpených SmaI (detekované PFGE) jsou méně časté. genotyp zjištěný PFGE se jeví jako stabilnější, mutace v genu flaA jsou častější a vytvářejí tak větší variabilitu PCR subtypů

REZISTENCE - DRŮBEŽ 2006 AMP TET NAL CMP ERY CIP GEN C.coli % R Tab. : Monitoring rezistence/senzitivity k vybraným ATB u kmenů C. coli and C. jejuni izolovaných z brojlerů (2006) 2006 AMP TET NAL CMP ERY CIP GEN C.coli % R (n = 24) 54 4 88 33 C. jejuni (n = 104) 46 20 53 22 52

BAŽANT OBECNÝ (Phasianus colchicus subsp. torquatus) Tab. : Monitoring výskytu termofilních Campylobacter spp. u bažanta obecného (2006) Původ Celkem C. coli C. jejuni C. coli + C. jejuni n / N % Farmy 212/302 70.20 107/302 35.43 87/302 28.81 18/302 5.96 Volně žijící 55/200 27.50 20/200 10.00 32/200 16.00 3/200 1.50

KŘEPELKA JAPONSKÁ (Coturnix coturnix japonica) vyšetřeno 50 ks zdravých zvířat z intenzivního chovu (2006) pozitivní nálezy – 86 % (obsah caeca) 70 % (36 %) - C. jejuni 34 % - C. jejuni + C. coli potencionální nebezpečí pro konzumenta (specifická skupina) – ostatní druhy chovaných ptáků (pernatá zvěř)

PRASE DOMÁCÍ (Sus scrofa f. domestica) Tab. : Monitoring výskytu termofilních Campylobacter spp. u jatečních prasat (2006) Rok 2006 Počet vyšetřených chovů* Campylobacter spp. C. jejuni C. coli směsný výskyt (C. jejuni + C.coli) n 12 ( n = 140) 117 99 6 CELKEM 83.57 % 10.26 % 84.62 % 5.12 % Monitoring ATB rezistence u izolovaných kmenů C. coli vzorky odebírány z vnitřní části recta před vykolením nízké nálezy na mase u prasat 35 % vyšetřených kmenů C. coli - multirezistentní

HUMÁNNÍ KMENY CAMPYLOBACTER SPP. získány jako klinické izoláty (n = 213) typizace mPCR, PCR/RFLP x biochemické testy C. jejuni – 80 % C. coli - 10 % C. jejuni + C. coli – 10 % subtypizace C. jejuni – vysoká variabilita genotypů Monitoring rezistence/senzitivity k vybraným ATB u kmenů C. coli and C. jejuni izolovaných z humánních pacientů AMP TET NAL CMP ERY CIP GEN C. coli % R (n = 6) 33 67 17 C. jejuni (n = 86) 37 12 42 6 36

DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST