Statistické hodnocení v SLP studiích SLP studie, u kterých se provádí statistické výpočty na našem pracovišti Residuální studie – mléko x tkáně – ochranná lhůta Farmakokinetické a bioekvivalenční studie ostatní – např. bezpečnostní studie na cílových zvířatech, studie lokální tolerance nebo studie stanovení dávky Ing. Věra Fialová

Postup statistického hodnocení v SLP Plán studie – popis metody statistického hodnocení, uvedení platných směrnic a uvedení statistických programů plánovaných na statistické hodnocení (odpovědné osoby, plán kontroly výpočtů a statistické zprávy) Statistického hodnocení podle typu studie, platných směrnic a plánu studie, vizualizace dat Statistická zpráva – všechna vstupní data, grafy, výstupy z programů, zhodnocení dat, závěr (délka ochranné lhůty, ekvivalence x ne-ekvivalence, významné výsledky)

Residuální studie – tkáně cílových zvířat Směrnice SLP http://www.ema.europa.eu, Veterinary regulatory, Scientific guidelines, Safety and residues: Pharmaceutical, Residues and withdrawal periods EMEA/CVMP/036/95 FINAL Note for Guidance: Approach towards Harmonisation of Withdrawal Periods Revize EMA/CVMP/SWP/285070/2013 připravovaná na rok 2016 EMEA/CVMP/563/02 Note for Guidance on Approach towards Harmonisation of Withdrawal Periods – Updated Application software (WT1.4) EMEA/CVMP/542/03 FINAL Guideline on Injection site residue Revize EMA/CVMP/520190/2007 Rev.1 EMA/CVMP/VICH/463199/2009: VICH GL48: Studies to evaluate the metabolism and residue kinetics of veterinary drugs in food-producing animals: marker residue depletion studies to establish product withdrawal periods.

Residuální studie – tkáně cílových zvířat Požadavky uvedené ve směrnici Pokud jsou všechna data v daný odběrový bod nižší než LOQ (LOD) je možné celý odběrový bod vyloučit z výpočtů pro výpočet je nutno použít minimálně 3 odběrovými body a v každém bodě musí být minimálně 3 zvířata Předpoklady pro data - statistický model homogenita rozptylu ln-transformovaných dat v každém odběrovém bodu (Cochran test or Bartlett’s test), linearita ln-transformovaných dat v čase (F-test), normální rozdělení odchylek (Shapiro/Wilk test). Pokud data nesplní požadavky dle směrnice a/nebo statistický model je vhodné použít alternativní postup pro stanovení ochranné lhůty Doporučený alternativní postup pro stanovení bezpečného rozpětí je čas, kdy všechna data klesnou pod MRL plus 10 – 30%.

Residuální studie – tkáně cílových zvířat Hodnocení ochranné lhůty se provádí pro každou tkáň nebo pouze injekční místo u injekčních přípravků (dle směrnic) Program je převzat z EMA – WT 4.1 Regresní analýza logarimovaných dat. Ochranná lhůta je stanovena jako čas, kdy jednostranný, 95 % horní toleranční limit pro 95 % konfidenční interval, klesne pod MRL nebo ADI Vyhodnocení se obvykle stanovení provádí pro maso, tuk, játra, ledviny a popřípadě injekční místo - pokud je stanoveno MRL nebo ADI (jen pokud není stanoveno MRL)

Residuální studie – tkáně cílových zvířat Závislost logaritmu koncentrace na čase s lineární regresí a 95% toleranční limit a graf rozložení odchylek (Q-Q graf)

Residuální studie – mléko Směrnice SLP http://www.ema.europa.eu, Veterinary regulatory, Scietific guidelines, Safety and residues: Pharmaceutical, Residues and withdrawal periods EMEA/CVMP/473/98 FINAL Note for Guidance for the Determination of Withdrawal Periods for Milk Revize EMA/CVMP/SWP/736014/2010 EMEA/CVMP/231/00/Rev 1 Updated Application Software relating to Note for Guidance for the Determination of Withdrawal Periods for Milk EMA/CVMP/VICH/463199/2009: VICH GL48: Studies to evaluate the metabolism and residue kinetics of veterinary drugs in food-producing animals: marker residue depletion studies to establish product withdrawal periods.

Residuální studie – mléko Stanovení ochranné lhůty na mléko podle typu dat Minimálně 19 zvířat Ochranná lhůta je stanovena jako čas, kdy jednostranný, 95 % horní toleranční limit pro 95 % konfidenční interval klesne pod MRL nebo ADI Metody stanovení TTSC – čas do bezpečné koncentrace, pro logaritmovaná data s vyhlazením monotonickou regresí, minimálně 3 koncentrace nad LOQ a linearita logaritmovaných dat (Time-to-safe-concentration) SCLR – bezpečná koncentrace s použitím lineární regrese pro logaritmovaná data a data mohou být pod LOQ (Safe concentration from linear regression) SCPM – bezpečná koncentrace pro data hodnocená po odběrech, data mohou být pod LOQ, není nutné splnit podmínku linearity, lze použít i pro menší počet zvířat (Safe concentration per milking)

Residuální studie – mléko Výpočet ochranné lhůty TTSC metodou

Farmakokinetické studie Směrnice SLP http://www.ema.europa.eu, Veterinary regulatory, Scietinfic guidelines, Efficacy, Pharmaceuticals EMEA/CVMP/133/99-FINAL, Committee for Veterinary Medicinal Products. Guidelines for the Conduct of Pharmacokinetic Studies in Target Animal Species. EMA/CVMP/EWP/81976/2010, Guideline on statistical principles for clinical trials for veterinary medicinal products (pharmaceuticals)

Farmakokinetické studie Typy farmakokinetických studií Jednorázové podání Vícenásobné podání Intravenozní podání extravaskulární nebo orální podání speciální farmakokinetické studie PK/PD studie TK studie Studie biologické dostupnosti Bioekvivalenční studie

Farmakokinetické studie Jednorázové - Intravenózní podání obecné farmakokinetické parametry Sklon a úsek eliminační části farmakokinetické křivky závislosti Ln-transformovaných dat na čase (mimo bodů pod LOQ) – minimálně 3 body. kel, Lz, λz – eliminační konstanta t1/2 – poločas eliminace AUC0-t , AUCt – plocha pod křivkou od 0 do posledního bodu (mimo bodů pod LOQ), výpočet lineární lichoběžníkovou metodou AUC0-∞ , AUCi – plocha pod křivkou od 0 do nekonečna AUMC – plocha pod momentovou křivkou MRT – střední doba zdržení speciální farmakokinetické parametry CL – clearance nebo CL/BW Vd – distribuční objem nebo Vd/BW

Farmakokinetické studie Jednorázové podání – extravaskulární nebo orální obecné farmakokinetické parametry jsou stejné jako pro intravenózní podání a další: Cmax – maximální koncetrace Tmax – čas dosažení maximální koncentrace speciální parametry kabs – absorpční rychlostní konstanta t1/2abs – absorbpční poločas Tlag – prodleva od podání léčiva do doby než je léčivo zjištěno v krevním oběhu

Farmakokinetické studie Mnohonásobné podání - extravaskulární nebo orální Obecné farmakokinetické parametry pro jednotlivá podání jsou stejné jako pro jednorázové podání a další: τ – interval mezi podáními Cmin – minimální koncentrace Cave – průměrná koncentrace, AUCτ/τ AUCss – plocha pod křivkou v rovnovážném stavu R – akumulační faktor, Rmax, Rave,Rkel

Farmakokinetické studie PK/PD studie obecné PK parametry PD parametry MIC – minimální inhibiční koncentrace – nejnižší koncentrace antibiotika, které inhibuje růst mikroorganismů in vitro PK/PD parametry Cmax/MIC50% or Cmax/MIC90% AUC/MIC50% or AUC/MIC90% AUCss/MIC50% or AUCss/MIC90% TC>MIC50% or TC> MIC90% %TC>MIC50% or %TC> MIC90%

Farmakokinetické studie Studie biologické dostupnosti (bioavailability) obecné PK parametry Absolutní biologická dostupnost – frakce Porovnání mezi extravasculárním a intravenózním podáním - poměr AUC dání Relativní biologická dostupnost Porovnání mezi různou formou podání - stejná dávka Srovnávací biologická dostupnost Porovnání mezi různou formou podání – různá dávka

Bioekvivalenční studie Směrnice SLP http://www.ema.europa.eu, Veterinary regulatory, Scietinfic guidelines, Efficacy, Pharmaceuticals EMEA/CVMP/133/99-FINAL, Committee for Veterinary Medicinal Products. Guidelines for the Conduct of Pharmacokinetic Studies in Target Animal Species. EMA/CVMP/EWP/81976/2010, Guideline on statistical principles for clinical trials for veterinary medicinal products (pharmaceuticals) EMEA/CVMP/016/00 Rev.2 (2011), Guidelines for the Conduct of Bioequivalence Studies for Veterinary Medical Products, EMA/CVMP/VICH/751935/2013, VICH GL52 on Bioequivalence: blood level bioequivalence study - Draft Guideline (End of consultation 31 May 2014)

Bioekvivalenční studie Srovnání různých veterinárních přípravků obsahujících stejnou aktivní látku o stejné dávce po jednorázovém podání (další možnosti dle uvedených směrnic) Experimentální design Paralelní design 1 perioda, 2 skupiny, 2 přípravky. Cross-over design 2 periody 2 sekvence,

Bioekvivalenční studie Stanovení počtu zvířat podle literatury nebo na základě pilotní studie –předpokládanou variabilitu a předpokládaný rozdíl mezi přípravky síla testu 80%, pravděpodobnosti 95% (α = 0.05) podle článku Dilleti at all :Sample size determination for bioequivalence assesment by means of confidence intervals , Výpočtem vhodným statistickým programem Podle směrnice VICH GL52

Bioekvivalenční studie Hodnocení bioekvivalenčních studií Výpočet PK parametrů stejně jako v PK studiích Hlavní parametry jsou AUC a Cmax Porovnání PK parametrů na základě ANOVA na hladině pravděpodobnosti 95 % AUC, Cmax – logaritmovaná data Efekt sekvence, periody, přípravku a mezi-skupinový efekt zvířete a sekvence (carry-over) Výpočet 90 % konfidenčního intervalu Vyhodnocení bioekvivalence v limitech pro konfidenční interval AUC 80 – 125 % Cmax 80 – 125 % nebo 70 – 143 %

Bioekvivalenční studie Statistická hypotéza H0: nulová hypotéza μT - μR  > limit Ha: alternativní hypotéza μT - μR  limit zamítnutím nulové hypotézy potvrdíme alternativní hypotézu výpočet provádíme na hladině pravděpodobnosti 95 %, síla testu by měla být  80 % v závislosti na počtu zvířat ANOVA – lineární regresní model

Bioekvivalenční studie Konfidenční limity – Li Ci = (mTI – mRI)  tα/2 σ (1 / NTI + 1 / NRI)1/2 m – průměr (popř. průměr log.hodnot) tα/2 – kritická hodnota Studentova rozdělení σ – průměru čtverců chyby ANOVA N – počet zvířat

Bioekvivalenční studie Zhodnocení správného provedení BEQ studie Odběrový čas musí být delší než Tmax + 3 x t1/2 Vymývací perioda musí být delší než  5 x t1/2 a koncentrace ve vzorcích před podáním 2. periody nesmí být vyšší než LOQ Limit kvantifikace analytické metody nesmí být vyšší něž 1/20 Cmax Zvolení AUCt nebo AUCi pro hodnocení bioekvivalence – pokud extrapolovaná část AUCi je větší ne 20 %, pak se pro hodnocení BEQ použije pouze AUCt pokud je významný efekt sekvence (carry-over ), je vhodné uvažovat pouze první periodu a vyhodnotit ji jako paralelní design (nevýhoda malého počtu zvířat)

Bioekvivalenční studie Statistická zpráva BEQ studie vstupní data tak, aby mohla být statistická analýza znovu provedena včetně popisné statistiky grafy časové závislosti koncentrace v normálním i logaritmickém měřítku, grafy průměrů sekvencí, period a přípravků hodnoty všech vypočtených farmakokinetických parametrů pro jednotlivá zvířata + popisné statistiky s ohledem na podaný přípravek výpočet ANOVA výsledky výpočtu konfidenčních intervalů zhodnocení správného provedení BEQ výstupy z programu

Ostatní studie Statistické hodnocení ostatních studií : Směrnice např. bezpečnostní studie na cílových zvířatech, studie lokální tolerance nebo studie stanovení dávky Obecné hodnocení rozdílů mezi skupinami, časy a další podobné výpočty Směrnice EMEA/CVMP/133/99-FINAL, Committee for Veterinary Medicinal Products. Guidelines for the Conduct of Pharmacokinetic Studies in Target Animal Species. EMA/CVMP/EWP/81976/2010, Guideline on statistical principles for clinical trials for veterinary medicinal products (pharmaceuticals)

Ostatní studie Statistické metody Parametrické: Ne-parametrické: ANOVA, T-tests nebo GLM models Předpoklad normality (Saphiro-Wiks test), rovnosti rozptylů Ne-parametrické: Kruscal Wallis ANOVA, Mann-Whitney U test, Wilcoxon párový test nebo Chi-kvadrát test Pravděpodobnost obvykle 95 % (α = 0.05) Stanovení počtu zvířat – síla testu, předpokládané rozptyly, rozdíly, síla testu 80 %

Děkuji za pozornost Ing. Věra Fialová