Metody s využitím reakce antigen-protilátka

Metody s využitím reakce antigen - protilátka Neznačený antigen/protilátka Precipitace Aglutinace Značený antigen/protilátka Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Radioimmunoassay (RIA) Western blotting Immunofluorescence Průtoková cytometrie 2

Význam metod a hodnocení Důkaz přítomnosti antigenu Důkaz přítomnosti protilátky Kvalitativní hodnocení – pozitivní x negat. Vznik zákalu, precipitátu, aglutinace Kvantitativní hodnocení – měření vzniklých IK

radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml Sensitivita metod precipitace - 30 mg/ml aglutinace - 1 mg/ml radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml 4

Precipitation reaction Agregáty vzniklé interakcí multivalentních protilátek a multivalentních makromolekulárních antigenů Precipitation reaction Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýrazněj ší, se nazývá optimální poměr a j e obvyke tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky. 5

Precipitační reakce Radiální imunodifúze Dvojitá difúze Ab + solubilní Ag Síť antigenů a protilátek Precipitace Stanovení imunoprecipitace: vizuálně metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení) Metody Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek - ve zkumavce Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu Radiální imunodifúze Dvojitá difúze Imunoelektroforéza 6

Radiální imunodifúze – jednoduchá, dvojitá Protilátka je rozpuštěná v gelu; Ag je přidán do jamek Měření koncentrace různých sérových proteinů, např. hladiny imunoglobulinů 7

Vyhodnocení RID podle MANCINIOVÉ, precipitace se měří po skončení imunodifúze (48 až 72 hodin) průměr prstence je přímo úměrný koncentraci Ag pokud není precipitace ukončená, vzniká křivka Stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, albuminu, alfa1-antitrypsinu, ceruloplasminu, alfa 2-makroglobulinu, transferinu, C1 inhibitoru

Dvojitá difúze (podle Ouchterlonyho) Ab a Ag difundují proti sobě Stanovení homogenity systému antigen-protilátka Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění Používáno následně po purifikaci směsi antigenů Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny V agaru bez obsahu antigenu nebo protilátky Závislost na poměru koncentrací antigenu a protilátky Identické Částečně identické Neidentické 9

Dvojitá difúze 10

Dvojitá difúze 11

Dvojitá difúze 12

Imunoelektroforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací pomocí dvojité difúze detekce presence nebo absence proteinu v seru 13

Aglutinační reakce Přímá aglutinace Pasivní aglutinace Ab + Ag nerozpustný (korpuskulární) Aglutinace (shlukování) Přímá aglutinace Pasivní aglutinace Aglutinační inhibice 14

Aglutinace - použití Identifikace mikroorganismů Identifikace živočišných buněk Identifikace erytrocytů Aglutinace přímá - s protilátkou reagují aglutinogeny na povrchu částic Nepřímá - reagují rozpustné antigeny nebo haptény, které se předtím pasivně adsorbovaly na povrch buňky nebo inertní částice Aglutinační reakce jsou citlivější než precipitační.

Přímá aglutinace Ag je přirozenou složkou částice Např. testování pacientova séra na přítomnost protilátek proti určité bakterii: Pacientovo sérum je sériově ředěno do zkumavek, mikrotitračních destiček s konstantním množstvím korpuskulárního antigenu. Poslední zkumavka s viditelnou aglutinací určuje titr protilátky v séru 16

Přímá aglutinace Stanovení protilátek proti erytrocytům Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG protilátky) Řešení: Coombsův test - použití anti imunoglobulinového séra Eg. Detection of anti-Rh antibodies in the blood of an Rh- woman 17

Coombsův Test Přímý: přidá se protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Promytí. Přidá se Coombsovo činidlo. stanovení Rh protilátek diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru) 18

Přímý a nepřímý Coombsův test Měření vázané protilátky Měření sérové protilátky 19

Pasivní aglutinace Aglutinace mezi protilátkou a solubilním antigenem vázaným na nesolubilní částici (latexová částice) Mnohonásobně zvýšení citlivosti oproti precipitační reakce Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních onemocnění Diagnostika autoimunitní thyroiditidy: Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta - Diagnostika revmatoidní artritidy 20

Inhibice aglutinace velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje. Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. Průkaz užívání drog (kokain, heroin). Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka). 21

Hemaglutinace 22

EIA x ELISA EIA – enzymoimunoanalýza Heterogenní – vyžadují separaci volné a vázané frakce analytu Homogenní – nevyžadují separaci imunochemická reakce s enzymatickou detekcí ke stanovení koncentrace antigenu nebo protilátky v neznámém vzorku ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay (speciální druh EIA) aktuálně heterogenní kompetitivní EIA se značenou protilátkou Enzymy – křenová peroxidása a alkalická fosfatása

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Principle of ELISA/RIA 1 2 3 4 Potažení jamek antigenem Přidání vzorku séra Přídání enzymem značené protilátky (anti-human IgG) Přidání substrátu Odečtení barevné reakce 24

Použití ELISA testů Stanovení cytokinů Stanovení autoprotilátek u systémových onemocnění (ANCA, anti-ds DNA) Speciální modifikace – CAP – specif. IgE (úprava hmoty pro navázání antigenu a použití fluorescenční detekce)

Western blot jako podskupina imunoblotingu detekce proteinů po elektroforéze v PAA gelu princip spočívá v elektrotransferu proteinů z gelu na membránu a následné detekci pomocí série protilátek Gel se vloží na membránu (vytvoří se sendvič) a pomocí elektrického proudu se proteiny z gelu přenesou na membránu, která je na sebe naváže. Membrána se potom podrobí inkubaci se sérií dvou protilátek, z nichž první/primární se váže s vysokou specifitou na daný protein. Druhá/sekundární protilátka bývá značena – alkalickou fosfatasou, peroxidasou Western blot – slovní hříčka, Southern blot – přenesení DNA z gelu na membránu, posléze Northern blot – pro RNA

Western blot Western blotting 27

Využití Western blot Autoprotilátky – antigangliosidové u neurologických autoimunitních onemocnění, autoprotilátky u hepatopatií

Imunofluorescence Přímá – vazba značené protilátky Nepřímá vazba primární protilátky a značené sekundární protilátky k detekci autoprotilátek. Sérum pacienta se nechá reagovat se substrátem. (normální tkáň jiného pacienta nebo tkáň zvířecí nebo buňky standardních buněčných kult). Detekce navázaných protilátek pomocí značených sekundárních protilátek, specifických vůči jednotlivým třídám lidských protilátek. 29

Průtoková cytometrie 30

Průtoková cytometrie: stanovení CD4 T buněk 31

Monitoring CD4 T buněk u HIV pacienta 32