Přehled analytických metod II.

Metody atomová spektrometrie (AAS, AES, kvantometry) molekulová spektrometrie (UV/VIS, IČ, NMR) chromatografie (GC, HPLC, TLC, CE) hmotnostní spektrometrie spojené techniky

Schéma spektrometrů emise absorpce fluorescence, rozptyl světla

Plamenová fotometrie plamen – monochromátor – fotoelektrický násobič – zpracování signálu plamen – odpaření roztoku, atomizace a excitace atomů (zářivou) deexcitací dochází k záření, jehož frekvence (vlnová délka) odpovídá rozdílu dvou energetických hladin elektronů záření prochází monochromátorem a dopadá na fotonásobič intenzita záření je závislá na množství analytu

Plamenová fotometrie princip plamenové emisní spektroskopie s použitím plamene o nízké teplotě (propan, butan, jejich směsi nebo zemní plyn) vlnové délky – Na+ - 589 nm, K+ - 767 nm, Ca2+ - 423 nm.. kvantitativní analýza alkalických kovů a kovů alkalických zemin vhodné pro stanovení v potravinách, nápojích, hnojivech, půdě, při těžbě kovů, v chemickém, farmaceutickém, papírenském a olejářském průmyslu

Atomová emisní spektrometrie atomizace a excitace atomů – zářivá deexcitace působení vysokých energií čím složitější elektronový obal atomu, tím složitější spektrum (větší počet čar ve spektru) čáry neionizovaných atomů, iontů budící zdroj – záření (lasery), elektrická energie (oblouky, jiskry, výboje, plazmatron), chemické energie (plameny) disperzní systém (mřížka, hranol) detekce – fotonásobič (historie – fotografická deska) kvantometry – rychlá multielementární analýza

Atomová absorpční spektrometrie plamen mřížkový monochromátor výbojka s dutou katodou zavádění aerosolu vzorku štěrbina FN dutá katoda – materiál ze stanovovaného kovu anoda – těžko tavitelný materiál (Zr, W..)

Atomová absorpční spektrometrie Monochromátor Fotonásobič mřížka dutá zrcadla uspořádání Czerny-Turner

Co s kolísáním signálu a neatomovou absorpcí ? VDK-výbojka s dutou katodou, DV-deuteriová výbojka, PZ-polopropustná zrcadla, DZ-dutá zrcadla, MOD-modulátor (rotující clona), PL-plamen (nebo grafitová kyveta), VZ-aerosol vzorku, MON-mřížkový monochromátor, FN-fotoelektrický násobič

AAS - shrnutí atomizace (zmlženého) vzorku v plameni emise záření s charakteristickými spektrálními čárami pro stanovovaný prvek – z duté katody absorpce tohoto záření atomy analytu v plameni (nebo kyvetě) zbytek záření (neabsorbované) prochází na fotonásobič fotonásobič převede fotony na elektrony, zesílí signál a zaznamená proud

Molekulová spektrometrie Ultrafialová a viditelná oblast (200 – 380 – 800 nm) absorpcí záření určité vlnové délky dochází k excitaci valenčních elektronů zdroj – deuteriová výbojka (UV), wolframová žárovka disperzní systém (hranol, mřížka, filtr) kyveta (křemenná – UV, skleněná, plastová), průtočná detekce – fotonásobič jednopaprskové dvoupaprskové diodové pole

Využití UV/VIS spektrometrie kvalitativní analýza – poloha a intenzita pásů ve spektru (charakteristické pro chromoforní skupiny v molekule), atlasy spekter, malé rozdíly – často doplňkové informace k dalším metodám) kvantitativní stanovení látek (kalibrace) Kalibrační graf - fenol y = 0.1542x - 0.0236 R 2 = 0.9979 0.2 0.4 0.6 0.8 4 6 koncentrace (mg/l) absorbance

Infračervená spektrometrie (IČ, IR) absorpce záření v oblasti (10 – 500 – 4000 – 10000) absorpce je spojená se změnou vibračních a rotačních stavů molekuly !! základní podmínka interakce IČ záření – musí docházet ke změně dipólového momentu během vibrace – HCl absorbuje, N2 neabsorbuje, CO2 ? kvalitativní analýza – poloha a intenzita pásů ve spektru ve spektru – valenční vibrace – vzdálenost jader - deformační vibrace – valenční úhly

IČ instrumentace zdroj záření – tuhé zářiče z polovodičových materiálů (globar – SiC, Nernstova tyčinka oxidy zirkonia a yttria) disperzní systém (několik mřížek, interferometr FT-IR) kyvety – pro kapaliny a plyny (materiál KBr, NaCl) pevné vzorky – tablety s KBr, nujolová suspenze (nasyc uhlovodíky –C20- C30), reflexní spektra detekce - termoelektrický článek zpracování signálu (odečet absorbance, v případě FT – matem. transformace, porovnání s databází)

IČ spektrum valenční vibrace oblast otisku prstu Y-H, násobné vazby C-halogen, mimorovinné deformační C-H oblast otisku prstu (C-C, C-N, C-O) valenční vibrace Y-H, násobné vazby

Příklady IČ vibrací Typ vibrace Skupina Vlnočet Intenzita n - OH 3600-3650 silná - OH s H-vazbou 3400-3550 silná (širší) nas - NH2 3480-3500 střední ns 3370-3420 - CH3 290-2970 -C=O 1850-1630 * d (rov) 1590-1650 střední-silná -C-Cl 600-800 -C-Br 500-650 d (mimorov) p- R1-benz.-R2 800-860 o- R1-benz.-R2 735-770

IČ spektrum

Nukleární magnetická rezonance (NMR) měřená látka je umístěna v silném magnetickém poli musí být přítomna jádra s nenulovým jaderným magnetickým momentem se absorpcí radiofrekvenčního záření dojde ke změně orientace magnetického momentu jádra – do vyšších energetických stavů (E1  E2) precesní pohyb Larmorova frekvence g-gyromag. poměr jádra do základní stavu přechází relaxačními procesy

NMR - instrumentace magnet (supravodivý) – a - póly, b - přídavné cívky pro změnu B vysokofrekvenční vysílač (elektromagnetické pole je orientováno kolmo na osu vnějšího pole magnetického) - c sonda – kyveta se vzorkem - e přijímač – indukční cívka - e zpracování signálu (pulsní techniky – Fourierova transformace) e, f, g – registrační část k – kontrolní oscilokop

NMR – chemický posun elektrony v okolí jádra ovlivňují velikost magnetické indukce v místě jádra  chemický posun d vM – frekvence měřeného pásu vST – rezonanční frekvence standardu (TMS)

Spin – spinová interakce a integrální intenzita signálu odpovídá počtu protonů A – důvod rozštěpení methylového píku - sousední methylenové protony ­­­ ¯­­ ­¯­ ­­¯ ¯¯­ ¯­¯ ­¯¯ ¯¯¯ 1:3:3:1 B – důvod rozštěpení methylenového píku - sousední methylenové protony ­­ ¯­ ­¯ ¯¯ 1:2:1

NMR - aplikace 1H-NMR, 13C-NMR, 19F-NMR strukturní analýza – spolu s MS nejsilnější nástroj vůbec !!! kvantitativní analýza studium rotace skupin v molekule, vodíkových vazeb

Separační techniky klasické techniky – destilace, extrakce, filtrace, centrifugace .. Chromatografie dělení podle mobilní fáze plyn – plynová chromatografie (GC) kapalina – kapalinová chromatografie (HPLC, TLC) Elektromigrační techniky kapilární elektroforéza, isoelektrické fokusace ...

Chromatografie

Plynová chromatografie 1-tlaková láhev (nebo generátor plynu), 2-regulace tlaku, 3-regulace průtoku, 4-dávkovací zařízení, 5-detektor, 6-termostat, 7-kolona, 8-zesilovač, 9,10-počítač

Plynová chromatografie nosný plyn – N2, H2, He, Ar dávkování vzorku – vyhřívaná nástřiková hlava plynové vzorky (10-1000 ml) kapalné vzorky (1-100 ml) pevné vzorky (příprava roztoků) split/splitless: nosný plyn kolona odpad

Plynová chromatografie kolony dnes prakticky výhradně kapilární kolony (průměr 0,1 – 0,5 mm, délka 10 – 100 m) sorbenty – silikagel, aktivní uhlí, molekulová síta, porézní polymery kapalné stacionární fáze – Carbowax (polyethylenglykol), polysiloxany, polyestery

Plynová chromatografie detektory - tepelně vodivostní detektor plamenový ionizační detektor nedestruktivní, méně citlivý, univerzální destruktivní, citlivý selektivní - uhlovodíky

Plynová chromatografie detektory - detektor elektronového záchytu nedestruktivní, citlivý, selektivní – halogenderiváty, nitrolátky - hmotnostní spektrometr – vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý

Plynová chromatografie analýza těkavých látek netěkavé látky – derivatizace, pyrolýza vysoká účinnost identifikace - retenční data kvantifikace – plocha (výška) píku výhodná kombinace s MS GC analýza PCB 1. 2-chlorbifenyl, 2. 4-chlorbifenyl, 3. 2,2'-dichlorbifenyl, 4. 2,4-dichlorbifenyl, 5. 4,4'-dichlorbifenyl, 6. 3,5,3'-trichlorbifenyl, 7. 2,4,4'-trichlobifenyl, 8. 2,5,2',5'-tetrachlorbifenyl, 9. 2,4,6,4'-tetrachlorbifenyl, 10. 3,4,4'-trichlorbifenyl, 11. 2,3,4,6,2'-pentachlorbifenyl, 12. 2,3,4,4'-tetrachlorbifenyl, 13. 2,3,4,5,2'-pentachlorbifenyl, 14. 2,4,5,2',4',5'-hexachlorbifenyl, 15. 2,3,4,2',4',5'- hexachlorbifenyl, 16. 2,3,4,5,2',3'-hexachlorbifenyl

Kapalinová chromatografie 1,2 – zásobníky mobilní fáze 3 – programování gradientu 4 – směšovač 5 – odplyňovač 6 – vysokotlaké čerpadlo 7 – tlumič tlakových pulsů 8 – trojcestný ventil 9 – saturační předkolona 10 – dávkovací zařízení 11 – kolona 12 – detektor 13 – jímač frakcí 14 – zesilovač 15, 16 – vyhodnocování - počítač

Vysokotlaká čerpadla velkoobjemová stříkačka Elektromotor s krokovým motorem Převodovka Závit na táhle pístu Píst Válec naplněný MF Ke koloně Ventil umožňující plnění čerpadla MF Zásobník MF pístová čerpadla – malý objem činné části Elektromotor Převodový mechanismus Píst Pracovní prostor válce Výtlačný ventil Nasávací ventil Ke koloně Zásobník mobilní fáze Těsnění pístu

Dávkovací ventily Schéma dávkování a) smyčka b) vnitřní dutina

Kolony Ovlivňování účinnosti Typy stacionární fáze homogenní a rovnoměrné plnění kolony sorbentem použití náplní s tenkou aktivní vrstvou na povrchu zmenšování částeček sorbentu monolity A – pórovitý silikagel (>25mm) B – povrch film stac. fáze C –povrchová pórovitost D – mikropartikulární náplně (3 - 20mm) Typy stacionární fáze chemická modifikace silikagelu - sorbenty C-18, C-8 (reverzní fáze), C-2 polymerní sorbenty (inertnost, menší mechanická stabilita) iontoměniče afinitní chromatografie

Detektory Typy detektorů Spektrofotometrický (UV-VIS) – absorpce záření Refraktometrický - index lomu Fluorescenční - fluorescence Elektrochemický - potenciál, proud Vodivostní - vodivost Light scattering - rozptyl světla Spojení s MS (MSn), IČ, NMR

Spektrofotometrický detektor 1–zdroj UV záření, 2-měrná cela, 3-referentní cela, 4 – fotočlánky, 5-optický systém detektoru, 6-přítok a odtok MF z kolony, 7-čistá MF

Detektor diodového pole

Fluorescenční detektor Schéma fluorimetrického detektoru nutnost derivatizovat (nebo fluoreskující látky) vyšší cena detektoru vysoká citlivost 1-excitační zář.; 2-emisní fluorescenční zář.; 3-křemenná cela; 4-štěrbina; 5-maska s počerněným povrchem; 6-konkávní zrcadla 7-fotonásobič

Vodivostní detektor Principem je měření vodivosti během HPLC analýzy. Průchod vodivých analytů způsobí změnu vodivosti. malý objem detekční cely (dvouelektrodové uspořádání) často v bezkontaktním provedení nejvíce využíván tam kde se analyzují ionty: iontoměničová chromatografie ion párová chromatografie kapilární elektroforéza

Spojení s hmotnostní spektrometrií Proč spojení HPLC/MS – co obě metody nabízí ? HPLC je základní technika pro separaci netěkavých látek (od malých molekul léčiv až po proteiny) hmotnostní spektrometr poskytuje informace pro identifikaci (molekulová hmotnost, struktura) při zachování ostatních vlastností detektoru (kvantifikace, sledování čistoty vzorku) umožňuje analyzovat látky bez chromoforu další rozměr selektivity separace (SIM, MS-MS pro izobarické látky)

Chromatogram Základní parametr chromatografie -0.1 0.4 0.9 1.4 1.9 5 10 15 20 čas signál wA wB tA tB Dt=tB- tA Základní parametr chromatografie - Rozlišení Analyticky významné parametry identifikace – retenční časy kvantifikace – plocha pod píkem – výška píku

Kapilární elektroforéza + - Fe Ff vi Fe ………….. elektrická síla Ff ………….. odporová síla Fe=zi.e.E Ff=k.h.vi pro kulové ionty k=6.p.ri Pro rovnost obou sil: zi.e.E = 6.p.h. ri .vi

Kapilární elektroforéza

Elektroosmotický tok A1 inj det EOF A2 N K2 K1 + - Sternova vrstva (pevná) difuzní vrstva -SiOH Û –SiO- + H+ (pKa ~ 6) Stěna kapiláry s disociovanými skupinami A1 inj det EOF A2 N K2 K1 + -

Detekce používají se kapiláry o velmi malém průměru (snadná disipace Jouleova ohřevu, kapilární síly převládají nad gravitací) 365 um 75 um

Detekce UV/VIS – adaptované cely z kapalinové chromatografie LIF – laserem indukovaná fluorescence spojení s ESI-MS

Využití kapilární elektroforézy vysoká účinnost pružnost při optimalizaci selektivity tolerance ke složitým matricím rychlost (high throughput) klinické a biochemické aplikace farmacie ( problémy s QC) životní prostředí průmysl

Hmotnostní spektrometrie ovlivňování pohybu iontů ve vakuu působením elektrického a magnetického pole určení poměru hmotnosti ku náboji měření intenzity iontů hmotnostní spektrum určení molekulové hmotnosti přítomnost a poměr izotopů přesné měření m/z – elementární složení iontu fragmentace iontů – informace o struktuře látky nejúčinnější identifikační nástroj v analytické chemii

Hmotnostní spektrometrie m/z=94 Dm/z=28

Hmotnostní spektrometrie fragmenty molekulární pík izotop chloru

Hmotnostní spektrometrie – blokové schéma vzorek ionizační komora elektrostatické prvky disperzní prvek svazky iontů zaostřovací plocha detektor registrace analyzátor

Způsoby ionizace vzorku náraz elektronu – electron impact EI chemická ionizace - CI bombardování rychlými elektrony - FAB elektrosprej - ESI chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI fotoionizace - APPI MALDI – matrix asisted laser desorption ionization

Způsoby ionizace vzorku Electron impact paprsek vysokoenergetických elektronů (70 eV) vyrazí elektron z molekuly a vzniká kladně nabitý radikál-kation (molekulární ion) pokud je molekulární ion nestabilní, dochází k fragmentaci.

Způsoby ionizace vzorku Chemická ionizace IH+ + M  MH+ + I nebo I+ + M  M+ + I v iontovém zdroji je přítomen plyn, který je ionizován elektronovým paprskem. Tento plyn se ionizuje. Srážkami s molekulami analytu se na analyt přenáší náboj – vzniká kation, který má málo energie na to, aby dále fragmentoval šetrný způsob ionizace, hlavním produktem je molekulární ion

Fast atom bombardment vzorek se ionizuje bombardováním paprsky urychlených atomů vhodných prvků – zpravidla Ar, Xe, Cs (energie 5-10 keV) vzorky se umisťují do polární viskozní a netěkavé kapaliny - glycerol užívá se pro určování sekvence v glykozidech a apetidech

Ionizace elektrosprejem LC eluent je sprejován v komoře za přítomnosti silného elektrostatického pole (za atmosférického tlaku) – vznikají nabité kapičky ohřívaný zmlžující plyn (nebo vyhřívaná kapilára) urychluje desolvataci kapiček aerosolu, velikost kapiček se zmenšuje, náboj roste při určité velikosti a náboji kapiček převládnou odpudivé elektrostatické síly nad silami kohezními – coulombická exploze – vznik volných iontů volné ionty jsou přitahovány a posléze prochází vzorkovací ústí do MS

Chemická ionizace za atmosférického tlaku eluent je sprejován vyhřívaným odpařovákem (250 – 400 °C) dochází k odpaření eluentu plynný solvent je ionizován elektrony v koronovém výboji (výbojová jehla) ionty solventu předávají náboj chemickou reakcí analytům (chemická ionizace) APCI se používá pro méně polární analyty než elektrosprej – je k elektrospreji komplementární u většiny přístrojů je výměna APCI za ESI snadná někdy se oba mody i kombinují

Fotoionizace - APPI                                                          eluent je sprejován vyhřívaným odpařovákem stejně jako APCI výbojka generuje fotony v úzkém rozsahu ionizačních energií ionizační energie jsou voleny tak, aby ionizovaly analyt a nedocházelo k ionizaci solventu podobné použití jako APCI význam: 1. analýza velmi málo polárních látek 2. malé průtoky (<100 ml/min) APPI je nejmladší technika

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization                                                          zvláště šetrný způsob ionizace, vhodný pro makromolekuly vzorek je spole s matricí (např. hydroxykyseliny) nasesen na terčíku na terčík se namíří laserový paprsek – dojde k excitaci matrice a přenesení energie na analyt -> vznikají ionty, které jsou urychleny do analyzátoru

Analyzátory 1. Sektorové analyzátory separace analytů podle různých hodnot m/z určité nastavení analyzátoru odpovídá určité hodnotě m/z (kalibrace) 1. Sektorové analyzátory

Kvadrupóly

Detektor doby letu – time of flight (TOF) rychlost měření přesných hmot analýza velkých molekul

Iontová past – možnost MSn

Iontová cyklotronová rezonance cyklotronová frekvence převrácená hodnota m/z při excitaci iontu oscilátorem s frakvencí stejnou jako je cyklotronová frekvence dochází ke spirálovitému pohybu (m/z(A)<m/z(B):

Iontová cyklotronová rezonance před excitací změna oscilace se měří jako střídavý proud. Jeho amplituda odpovídá počtu iontů – kvantita Frekvence odpovídá cyklotronové frekvenci iontu při excitaci Rf excitace detegovaný proud po excitaci Fourierova transformace běžné spektrum