Nukleové kyseliny Význam genetické informace, její replikace a exprese pro živý organismus DNA – struktura, vlastnosti a funkce v organismu RNA – dtto Virus ( = parazitující soubor genů) Možné využití syntetických oligonukleotidů Technické použití nukleových kyselin: aptamerové senzory, DNA nanomateriály

Znaky živého organismu získávání energie z živin pro své životní potřeby    možnost růstu, diferenciace a reprodukce aktivní udržování vnitřní uspořádanosti    aktivní reakce na změny vnějších podmínek Všechny tyto životní projevy se realizují primárně na úrovni buněk

Jednotná molekulární strategie buněk Polysacharidy a lipidy … stavební a zásobní Bílkoviny (proteiny) … univerzální, mohou mít funkci: stavební, zásobní, biochemickou (enzymy), transportní, pohybovou, kontrolní, signální,.. Specifický vztah mezi strukturou a funkcí: posloupnost aminokyselin  struktura  funkce Kritická podmínka pro zachování životních pochodů buňky: mít možnost podle potřeby vytvořit protein pro zabezpečení dané funkce To zajišťují Nukleové kyseliny: v DNA je informace uložená, RNA je prostředníkem její realizace (exprese)

Centrální dogma molekulární biologie Přenos genetické informace v živých organismech vždy DNA  RNA  protein

DNA je polymerní řetězec, vzniklý polymerací nukleotidů. Chemické složení DNA DNA je polymerní řetězec, vzniklý polymerací nukleotidů. Nukleotid = báze + deoxyribóza + + fosfátová skupina Asymetrický řetězec s jasně rozlišeným 5’ a 3’ koncem.

Uspořádání DNA DNA je v buňkách ve formě dimeru tvořeného antiparalelně uspořádanými řetězci s komplementárním bázovým složením.

Rozsah buněčné genetické informace Kompletní genetická informace organismu = genom. Prokaryota: Genom obsahuje typicky jednotky tisíc genů. Existují však i primitivní bakterie s méně než 100 geny. ________________________________________________ Eukaryota: Desetitisíce až statisíce genů v genomu. Primitivní eukaryota nemají o mnoho více genů než nejlépe geneticky vybavená prokaryota (kvasinka Saccharomyces cerevisiae má 6 tisíc genů).

Příklad genu

Uložení DNA v buňce Genom prokaryot je uložen v jediné molekule DNA, která je cyklická. __________________________________________________ V případě eukaryot je genom představován sadou molekul DNA, které jsou základem jednotlivých chromosomů. Například somatické (nepohlavní) lidské buňky obsahují dvě sady po 23 chromosomech. V každém chromosomu je DNA o délce kolem 10 cm. Délka a počet DNA molekul v jádře vylučuje jejich volné uložení. Proto dochází k několikastupňové organizaci. Ta je maximální při přípravě pro buněčné dělení, kdy jsou zformovány chromosomy. Při ostatních životních fázích buňky dochází k částečnému rozvolnění: struktura DNA + podpůrné proteiny = chromatin

Vyšší stupně uspořádání Nukleosomy jsou vázány na další vláknový histon a tvoří „30 nm vlákno“. To je dále zprohýbáno a organizováno. Díky uspořádání je délka chromosomu 10.000x menší než délka rozvinuté DNA. Při ostatních životních fázích buňky dochází k rozvolnění. Málo rozvolněný chromatin (heterochromatin) je nedostupný pro expresi genetické informace. I v nejvíce rozvolněném chromatinu zůstává struktura nukleosomů. Základní pochody na DNA, tj. replikace, transkripce nebo opravy mohou probíhat přes nukleosomy.

Uspořádání v jádře V jádře se chromosomy (= molekula DNA + histony) uspořádávají do více a méně rozvinutých oblastí.

Předávání a rekombinace genetické informace Genetická informace při diferenciaci buněk nemizí

Replikace DNA Přesnost replikace: prostá syntéza DNA vlákna: pravděpodobnost chyby 1:100000 bezprostřední kontrola a oprava: pravd. chyby 1:100 další kontrola a oprava na novém vláknu: pravd. chyby 1:100 Celková pravděpodobnost chyby při replikaci: 1 : 1 miliarda

Důležitost předávání genetické informace Je to především pojistka proti současnému poškození životně důležitých genů u celého společenství jednotlivců U bakterií je možné předání malého množství DNA přímo mezi jedinci, nebo i z okolí buňky. Dobře se uplatňují plasmidy, malé kruhové DNA U eukaryot se děje předávání genetické informace při pohlavním rozmnožování Somatické buňky jsou diploidní – mají vždy 2 páry chromosomů, jeden od otce a jeden od matky, které se spojily při oplození, kdy se do jednoho jádra dostaly chromosomy z samční i samičí podhlavní buňky.

Zápis genetické informace U všech organismů se zápis genetické informace realizuje v molekule DNA = deoxyribonukleová kyselina a to pořadím čtyř bází: Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin Přenos genetické informace podle principu KOMPLEMENTARITY pouze bázové páry A:T, G:C

Co je příčinou principu komplementarity ? Pouze při zachování principu komplementarity lze při libovolném řazení čtyř bází na jednom řetězci vytvořit pravidelnou strukturu dvojšroubovice

Stabilita dvojšroubovice DNA Relativně velká citlivost na vnější podmínky: teplota, tlak, pH, koncentrace kationtů, koncentrace jednotlivých vícemocných iontů Závislost stability na stavbě DNA - délce řetězce - bázovém složení: stabilita roste s podílem G:C párů Zvláštní struktury DNA podmíněné speciálním bázovým složením: - alternující G a C ………………………….levotočivá šroubovice pouze A a G v jednom vlákně … ……….trojšroubovice pouze G …………………………. ……….kvadruplex - úsek pouze s A a T s alternacemi ………ohyb

RNA - chemické složení DNA RNA Chemické složení RNA se od DNA liší pouze ve dvou detailech Místo báze Thymin je Uracil (Uracil nemá methylovou skupinu) Místo deoxyribózy je ribóza (má OH skupinu v pozici 2’)

Role RNA Centrální dogma molekulární biologie: Přenos genetické informace v živých organismech vždy DNA  RNA  protein RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolích mRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselin rRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů) tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách

Postup exprese genetické informace Eukaryota Prokaryota RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolích mRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselin rRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů) tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách

Strukturní rysy RNA RNA se zásadně vyskytuje jako jednovláknová, může ale vytvářet lokální interní dvojšroubovice a stabilizovat se ve složité prostorové struktuře. Základními strukturními motivy jsou vlásenka (hairpin, hairpin loop) - obsahuje vlastní smyčku a stonek (stem), výduť (bulge), vnitřní smyčka, křížení (junction)

Struktura 5´konce viru HIV-1 TAR – vlásenka, na kterou se vážou proteiny virový Tat a buněčný CyclinT1 DIS (SL1) – vlásenka, která je zodpovědná za držení obou homologních vláken viru při sobě

Viry Samostatně existující skupiny genů. Mohou se replikovat pouze pokud infikují vhodnou hostitelskou buňku. Nebuněčné částice, nepovažují se za živý organismus. Mimo hostitelskou buňku nevykazují životní projevy: nemají látkový ani energetický metabolismus, nerostou, nejsou dráždivé, nemají aktivní pohyb, nerozmnožují se. Žádný z virů neobsahuje geny klíčové pro jeho replikaci, především pro stavbu ribosomu nebo syntézu ATP.   V procesu své reprodukce představují vnitrobuněčné parazity, kteří jsou zpravidla patogenní pro hostitelskou buňku. Obsahují 3 až stovky genů a jejich velikosti se pohybují od 15 do cca 400 nm.

Životní cyklus DNA viru Lytický cyklus – s využitím buněčného aparátu (permisivita buňky) se replikuje nukleová kyselina i virové proteiny. Kapsidové proteiny se v procesu tzv. maturace samovolně skládají a vytvářejí kapsid, sestavují se nové viriony. Konkrétní mechanismus závisí především na tom, jak je realizován zápis virových genů: DNA viry - přímá transkripce a translace virové DNA

Životní cyklus retroviru RNA je virovou reverzní transkriptázou přepsána do DNA a ta je virovou integrázou včleněna do buněčné DNA v jádře

Použití oligonukleotidu k „uspání“ genu oligonukleotid = krátký úsek nukleové kyseliny Motivace: Chemoterapie: Selektivní likvidace nežádoucích organismů Potlačení reprodukce virů, především retrovirů Potlačení růstu vlastních buněk s patogenním chováním 2. Molekulární biologie: Efektivní zkoumání funkcí řízených jednotlivými geny

Možné mechanismy • Antigenní – oligonukleotid se váže na dvojšroubovici DNA a vytváří triplex; blokuje transkripci (vznik mRNA) • Antisensní – oligonukleotid se váže na mRNA a vytváří duplex; blokuje translaci (syntézu proteinů) nebo dokonce vede ke štěpení mRNA pomocí RNasy H • Aptamerní – oligonukleotid zabraňuje funkci proteinu zajišťujícímu nezbytný krok v realizaci genetické informace (reverzní transkriptáza, integráza, apod.) • siRNA – krátká dvojšroubovice RNA obsahující nežádoucí sekvenci • Ribozymy – speciální RNA sekvence katalyzující štěpení mRNA

Chemicky modifikovaná analoga nukleových kyselin Krátké úseky přírozených nukleových kyselin nejsou v buněčném prostředí stabilní – působení štěpících enzymů (nukleázy) První generace antisense léků: Založené na fosforothioátech Aktivují RNázu H Desítky přípravků ve stadiu klinických testů, jeden lék povolen pro lékařské použití Problémem je nespecifická vazba na nukleové kyseliny a proteiny Druhá a třetí generace antisense léků: Založené na ochranných O-methyl nebo O-methoxy-ethyl skupinách, někdy v kombinaci s fosforothioáty (2.generace) nebo jiné typy modifikací (3.generace) Neaktivují RNázu H, řeší se to tvorbou „chimerických“ oligonukleotidů Více než desítka ve stadiu klinických testů

Výběr z přehledu testovaných přípravků

To je motivace pro hledání nových, vhodnějších modifikací Žádná z dosud používaných modifikací nemá bohužel optimální vlastnosti, aby se mohl plně využít potenciál antisensní strategie To je motivace pro hledání nových, vhodnějších modifikací Požadavky na syntetická analoga nukleových kyselin pro terapeutické použití dostatečná stabilita vůči enzymům v buňce štěpícím nukleové kyseliny specifická afinita k cílovému úseku přirozené nukleové kyseliny s komplementární bázovou sekvencí - pro antisense aplikaci schopnost aktivovat enzym RNáza H -  úspěšné pronikání do buněk a správná distribuce ve vnitrobuněčném prostředí - netoxičnost a to ani metabolických produktů

Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i modifikovaných nukleových kyselin Studované problémy tvorba a rozpad duplexů, triplexů a kvadruplexů vliv vnějších podmínek : pH, jednotlivé kationty, speciální molekuly stabilita a dynamika duplexů s neúplnou komplementaritou struktura, dynamika a interakce s enzymy regulačních úseků DNA interakce s enzymy (HIV integráza, RNasa H) významné pro terapii interakce vazebných strukturních motivů s aptamery (TAR smyčka) pronikání oligonukleotidů do buněk a jejich vnitrobuněčný osud

Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i modifikovaných nukleových kyselin Používané metody UV absorpce Ramanova spektroskopie senzory na bázi rezonance povrchových plasmonů mikrokalorimetrie strukturní a dynamická NMR měření cikulární dichroismus (v UV absorpci) gelová elektroforéza mikrofluorescenční techniky počítačové modelování

Testování syntetických oligonukleotidů Testování vazby na přirozený řetězec – SPR biosenzor

Specificita vazby (výsledky UV absorpce) - Seznam Jardovych modifikaci ??? Do grafu pridat Binding efficiency of polyA:polyU systém ??? - Jen triplexy × presto vyber modifikaci vhodnych pro antisense, neboť pokud netvoril ani triplexy nemohl by vytvorit duplexy s otevrenym zlabkem - Testovano mnoho modifikaci a znich vybrana ta nejvhodnejsi s ještě lepsimi schopnostmi nez prirozene ApA - Konformace = postaveni bazi, puckering cukru, konformace fosfodiesterove spojky

stabilita komplexu s přirozeným vláknem, strukturní podobnost (UV absorpce, počítačové simulace, Ramanův rozptyl) biochemický test: aktivace RNasy H - Seznam Jardovych modifikaci ??? Do grafu pridat Binding efficiency of polyA:polyU systém ??? - Jen triplexy × presto vyber modifikaci vhodnych pro antisense, neboť pokud netvoril ani triplexy nemohl by vytvorit duplexy s otevrenym zlabkem - Testovano mnoho modifikaci a znich vybrana ta nejvhodnejsi s ještě lepsimi schopnostmi nez prirozene ApA - Konformace = postaveni bazi, puckering cukru, konformace fosfodiesterove spojky