Pracovní metody v botanice: karyologie + průtoková cytometrie 160 320 480 640 800 250 500 750 1000 2x 4x Relative fluorescence Number of nuclei karyologie + průtoková cytometrie

K a r y o l o g i e = studium buněčného jádra, zejména chromozómů charakteristiky chromozómů: - počet - morfologie - velikost (absolutní i relativní) - barvitelnost

Počty chromozómů - počet chromozómů (haploidní buňky: n somatické buňky: 2n) - základní chromozómové číslo (x) - akcesorické (B) chromozómy - polyploidie - aneuploidie - somatické mozaiky - endopolyploidie

Počty chromozómů - rekordy Haplopappus gracilis 2n = 4 Viola modesta Ophioglossum reticulatum 2n = 96x = 1440 Sedum suaveolens - 2n = 80x = 640 Voaniola gerardii - 2n = 50x = 596

Stavba chromozómů

Morfologie chromozómů - centroméra, sekundární konstrikce, satelit - difúzní centroméra

Změny tvaru chromozómů - pericentrické inverze - nerovnoměrné translokace - delece, duplikace - fúze

Charakteristiky karyotypu - symetrický x asymetrický (evoluce) - bimodální

Velikost chromozómů - polyténní chromozómy - B chromozómy cévnaté > bezcévné heterosporické > homosporické nahosemenné > krytosemenné bylinné typy > dřevnaté

Obsah jaderné DNA C-hodnota velikost genomu Fritillaria assyriaca C = 127.4 pg Arabidopsis thaliana C = 0.1 pg

Barvitelnost chromozómů - euchromatin x heterochromatin - pohlavní chromozómy

A n e u p l o i d i e - hypo-aneuploidie - hyper-aneuploidie

P o l y p l o i d i e - ortopolyploidie x anortopolyploidie - autopolyploidie x allopolyploidie - výhody polyploidů

Allopolyploidie - Primula Primula floribunda 2n = 2x = 18 Primula kewensis 2n = 2x = 18 2n = 4x = 36 Primula verticillata 2n = 2x = 18

Allopolyploidie Galeopsis pubescens 2n = 2x = 16 Galeopsis speciosa Galeopsis tetrahit 2n = 4x = 32 Galeopsis pubescens 2n = 2x = 16 Galeopsis speciosa 2n = 2x = 16

Allopolyploidie

Autopolyploidie Dactylis glomerata 2n = 2x = 28 Dactylis polygama

Tragopogon porrifolius Polytopní vznik Tragopogon porrifolius 2n = 2x = 12 Tragopogon pratensis 2n = 2x = 12 Tragopogon dubius 2n = 2x = 12 Tragopogon miscellus 2n = 4x = 24 Tragopogon mirus 2n = 4x = 24

Buněčný cyklus

Mitotické dělení

Meiotické dělení

Metody - roztlakové preparáty - výběr materiálu 1) předpůsobení 1-bromnaftalen (nasycený roztok, 0,5 - 4 hod.) p-dichlorbenzen (bnasycený roztok, 3 - 5 hod) 8-hydroxychinolin (0,002 M, 3 - 4 hod) kolchicin (0,01 - 0,5 %, 0,5 - 3 hod) 2) fixace ethanol : ledová kys. octová (3 : 1), 2 - 24 hod. 3) macerace ethanol : HCl (1 : 1), 1 - 3 min. 1N - 2N HCl, 60°C, 5 - 15 min 4) barvení lakto-propion-orcein acetokarmín

Metody - roztlakové preparáty

Metody - průtoková cytometrie

Příprava FCM vzorků

Výhody průtokové cytometrie - rychlost - jednoduchá příprava vzorků - nedestruktivnost - nevyžaduje mitoticky aktivní buňky - detekce smíšených vzorků

Využití průtokové cytometrie Analýza protoplastů (velikost, obsah DNA, RNA, proteinů, chlorofylu, alkaloidů, buněčný cyklus, syntéza buněčné stěny, třídění) Analýza izolovaných jader (obsah DNA, poměr AT:CG bází, struktura chromatinu, obsah RNA, proteinů, třídění) Analýza izolovaných chromozómů (velikost, centromerický index, obsah DNA, poměr AT:GC bází, třídění)

Botanické aplikace Podrobnější analýza jaderného genomu (velikost, složení genomu u allopolyploidů, odhad poměru AT:CG bází) Analýza ploidního stupně (detekce nových ploidií, detekce heteroploidních kříženců, detekce endopolyploidie, detekce aneuploidie, určení pohlaví dioecických rostlin, detekce reprodukčního způsobu) Další aplikace (struktura chromatimu, analýza buněčného cyklu, vliv radiace, třídění chromozómů)

Determinace druhů a jejich hybridů Anthoxanthum 2x - A. alpinum 4x - A. odoratum Empetrum 2x - E. nigrum 4x - E. hermaphroditum Veronica hederifolia agg. 2x - V. triloba 4x - V. sublobata 6x - V. hederifolia

Determinace druhů a jejich hybridů Polypodium cambricum 2n = 2x = 74 Polypodium vulgare 2n = 4x = 148 Polypodium interjectum 2n = 6x = 222 2x 6x

Determinace druhů a jejich kříženců Empetrum - 3x Dryopteris

Otázky vyšších taxonomických kategorií - Ranunculaceae s.l. - vývojové centrum (Hypochaeris)

Obsah jaderné DNA - využití - objem jádra a buňky - délka mitózy a meiózy - hmotnost a objem semen - minimální reprodukční doba - fenologie - parametry prostředí - molekulární praxe (AFLP) - fylogenetické analýzy

Příbuzenské vztahy Rozdíly v C - hodnotách H. pilosella C = 1.74 pg H. lactucella C = 2.03 pg H. onegense C = 2.11 pg H. caespitosum C = 2.04 pg H. aurantiacum C = 1.93 pg H. bauhinii C = 1.97 pg H. schultesii C = 1.80 pg (H. lactucella x H. pilosella) H. floribundum C = 2.04 pg (H. lactucella x H. caespitosum) H. brachiatum C = 1.78 pg (H. pilosella x H. bauhini) stejný počet chromozómů rozdílná velikost genomu

Analýza reprodukčního způsobu

Reprodukční způsob

Původ potomstva Experimentální hybridizace 6x x 4x Potomstvo: 160 320 480 640 800 250 500 750 1000 2x 4x Relative fluorescence Number of nuclei Experimentální hybridizace 6x x 4x Potomstvo: 6x (apomixie) 3x (haploidní partenogenéze) 5x (redukované gamety) 7x (redukovaná + neredukovaná gameta) 8x (neredukovaná + redukovaná gameta)

Studium smíšených populací Oxycoccus: Galeobdolon 2x + 4x + 5x + 6x 2x + 3x + 4x Empetrum: Hieracium (echioides) 2x + 3x + 4x 2x + 3x + 4x Anthoxanthum Campanula patula: < 2x + 2x (2x + 4x) 2x + 4x, 6x + 8x

Studium smíšených populací 4x 2x 3x Krkonoše Empetrum 2x + 3x + 4x 2x 2x + 3x 3x 4x * Mumlavská hora Jeřábí louka 100 m

Další techniky - proužkování - FISH, GISH