VYŠETŘENÍ BUŇKAMI ZPROSTŘEDKOVANÉ IMUNITY

HODNOCENÍ SPECIFICKÉ BUNĚČNÉ IMUNITY Je nutné pro efektivní diagnostiku: primárních imunodeficiencí sekundárních imunodeficiencí (infekce, malnutrice, trauma, nádory, účinky terapie) autoimunitních imunopatologických nemocí ZÁKLADNÍ KLINICKÉ PROJEVY PORUCH SPECIFICKÉ BUNĚČNÉ IMUNITY opakované infekce plic, GIT, kůže virové infekty intracelulární bakterie (M.tuberculosis) oportunistické infekce (r. Candida, Pneumocystis carinii)

DIAGNOSTICKÉ LABORATORNÍ POSTUPY JSOU KOMPLEXNÍ jsou navrhovány na základě podrobného klinického vyšetření jsou hodnoceny v kontextu klinického stavu ZÁKLADNÍ TESTY: - počet leukocytů, dif. KO, abs. počty VÝBĚROVÉ TESTY: - vlastní imunologické vyšetřovací metody

intradermální aplikace anamnestických na thymu závislých I) KOŽNÍ TESTOVÁNÍ: intradermální aplikace anamnestických na thymu závislých antigenů mikrobiálního původu ANAMNESTICKÉ AG: předpokládá se předchozí kontakt přirozená expozice: candidin, toxoplasmin umělá expozice = aktivní imunizace (tetanový toxoid) INDURACE po 48 hodinách (reakce pozdní přecitlivělosti) histologicky infiltrace CD4+ T lymfo a makrofágy INTERPRETACE: pozitivita = neporušená T buněčná imunita negativita = anergie

II) EX VIVO LABORATORNÍ TESTY kvantifikace počtu buněk imunitního systému (krev, jiné tekutiny a tkáně) funkční testy KVANTIFIKACE BUNĚK IMUNITNÍHO SYSTÉMU NĚKDY VYŽADUJE SEPARACI BUNĚK

IMUNOFENOTYPIZAČNÍ ANALÝZA LEUKOCYTŮ morfologická kritéria jsou nedostatečná identifikace buněčných populací průkazem membránových molekul monoklonálními protilátkami imunochemický průkaz povrchových (CD) molekul (CD1 – CD247)

IMUNOFLUORESCENČNÍ ANALÝZA MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY JSOU OZNAČENY FLUOROCHROMY: energie potřebná k excitaci fluorochromů je zíkávána z UV světla nebo laserového paprsku je vyzařováno světlo, jehož barva závisí na vlnové délce emise 660 - 680 630 - 635 ALOPHYKOCYANIN (APC) 570 - 590 490 - 580 PHYCOERYTHRIN (PE) 510 - 540 470 - 510 FITC emise absorbce (nm) flurochrom

fluorochrom je konjugován s primární protilátkou - analýza plné krve - průtoková cytometrie

primární protilátka je neznačená - označena je sekundární protilátka - izolované buňky, imunohistochemie - UV mikroskopie

IMUNOFLUORESCENČNÍ ANALÝZA PLNÉ KRVE odpadá separace buněk přímá imunofluorescence inkubace heparinizované krve se značenou monoklonální protilátkou hypotonická lýza erytrocytů odstranění nenavázané protilátky měření Při použití různých monoklonálních protilátek označených rozdílnými fluorochromy lze provést současný průkaz dvou až tří znaků (případně kombinací membránových a nitrobuněčných molekul).

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE vrchol současných možností analýzy buněčných suspenzí částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady cytometrie určuje: - počet - velikost (FS) -„morfologii“ buněk (SS) - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) údaje získané pro jednotlivé buňky jsou vyhodnoceny počítačem

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE MATERIÁL: - plná krev, punktáty kostní dřeně - separované buněčné populace - jiné tělní tekutiny (likvor, ascites, exudáty) - buněčné suspenze získané dezintegrací tkáně buněčné suspenze jsou značeny imunofluorescencí používají se monoklonální protilátky proti: - membránovým molekulám - cytoplazmatickým molekulám - jaderným molekulám

APLIKACE PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE určení různých populací leukocytů (jiných buněk) IMUNOFENOTYPIZAČNÍ PRŮKAZ buněk krevních malignit měření PROLIFERAČNÍ AKTIVITY buněk: - měří se obsah DNA - DNA je označena interkalárními látkami, které fluoreskují - měření O2 závislých mechanismů zabíjení FAGOCYTUJÍCÍCH BUNĚK: - granulocyty (plná krev) jsou inkubovány s látkou, která je působením nitrobuněčných mechanismů převedena na látku fluoreskující

APLIKACE PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE stanovení buněčné ploidie stanovení nitrobuněčných biologicky aktivních molekul: - cytokinů (TH1, TH2 subsety) - molekul regulujících buněčný cyklus - molekul regulujících apoptózu - produktů onkogenů a antionkogenů

KLINICKY VÝZNAMNÉ POPULACE LEUKOCYTŮ CD3+ T lymfocyty: populace zralých T lymfocytů 50 - 75% CD4+ T lymfocyty: subpopulace pomocných induktorových T lymfocytů 30 - 60% CD8+ T lymfocyty: subpopulace tlumivých cytotoxických T lymfocytů 15 - 30% CD25+ T lymfocyty: aktivované T lymfocyty 1 - 5% CD19+ B lymfocyty: populace zralých B lymfocytů 5 - 15% CD56+ NK buňky: přirozeně zabíječské buňky 5 - 15% CD14+ buňky: monocyty CD15+ buňky: granulocyty CD38+ buňky: plazmatické buňky

je založeno na testování: schopnosti T lymfocytů proliferovat FUNKČNÍ TESTY TESTOVÁNÍ FUNKCÍ T LYMFOCYTŮ IN VITRO je založeno na testování: schopnosti T lymfocytů proliferovat schopnosti T lymfocytů produkovat cytokiny PROLIFERACE T LYMFOCYTŮ: in vitro kultivace kultivační media (thymové působky) CO2 atmosféra

AKTIVÁTORY: MITOGENY: - rostlinné lektiny - polyklonální aktivátory - specifická vazba na membránové cukry - nespecifický proliferační podnět - phytohemaglutinin (PHA) ANTIGENY: - specifická stimulace klonu T lymfo prostřednictvím TcR (PPD) NÍZKOMOLEK. LÁTKY: - phorbolové estery

Buněčná proliferace je měřena: mírou inkorporace izotopem značených nukleotidů (3H thymidin) do nově tvořené DNA analýzou buněčného cyklu (cytometrie) Funkční testy jsou doplňující testům kvantifikující počty buněk imunitního systému.

PŘIROZENĚ CYTOTOXICKÉ BUŇKY – IN VITRO DIAGNOSTIKA heterogenní populace usmrcují buňky infikované viry, infekční agens a nádorově transformované buňky nejdůležitější populace jsou NK buňky NK BUŇKY: CD56+ (NCAM-1) Aktivita NK buněk: je testována lytická aktivita NK buněk terčová linie je označena radioaktivním Cr suspenze označených terčových buněk je smíchána s izolovanými lymfoidními buňkami (obsahují NK buňky) během inkubace jsou terčové buňky lyzovány a do supernatantu se uvolňuje radioaktivní Cr uvolněná radioaktivita je funkcí NK cytotoxicity

HODNOCENÍ FAGOCYTÁRNÍCH FUNKCÍ absolutní počet granulocytů je pro funkci fagocytózy kritický k testování fagocytózy se používají izolované granulocyty populace granulocytů je mimořádně citlivá na poškození nově lze hodnotit počty a funkce fagocytujících buněk průtokovou cytometrií

AKTIVACE A ADHERENCE FAGOCYTUJÍCÍCH BUNĚK: je testována schopnost adherovat k pevným povrchům je testována přítomnost a denzita exprese adhezních molekul imunofluorescencí LAD-I syndrom: - absence  řetězce (CD18) integrinového heterodimeru LFA-1

CHEMOTAXE: orientovaný pohyb granulocytů v chemoatraktivním gradientu migrace granulocytů pod agarózou poruchy chemotaxe: - primární defekty: syndrom líných leukocytů - sekundární defekty: diabetes, popáleniny

INGESCE: nezbytná přítomnost „opsoninů“ inkubace heparinizované krve s teplem inaktivovanými kvasinkami granulocyty s pohlcenými kvasinkami jsou po obarvení identifikovány mikroskopicky

NITROBUNĚČNÉ ZABÍJENÍ: CIDIE KRVE: hodnotí komplexní cidní mechanizmy fagocytů inkubace plné krve s kmenem E.coli rezistentním vůči sérovým faktorům

O2 NEZÁVISLÉ MECHANIZMY: imunochemické stanovení defensinů stanovení lysozymu deficience specifických granul O2 ZÁVISLÉ MECHANIZMY: INT (NBT) - test izolované granulocyty jsou stimulovány škrobovými zrny za přítomnosti iodnitrotetrazolia (bezbarvé) kyslíkové metabolity (O2-.) produkované aktivitou NADPH oxidázy přeměňují INT na barevný formazan zbarvení je spektrofotometrováno CGD: - defekt sestavování NADPH oxidázového komplexu - netvoří se barevný formazan