Monomerní G proteiny Alice Skoumalová

Opakování: Chemický přenos signálu (obecná charakteristika, typy dle vzdálenosti místa ovlivnění, typy receptorů) Příklady signálních látek Iontový kanál Receptor s kinázovou aktivitou Receptor spřažený s G-proteiny

Přenos signálu

Typy membránových receptorů: 1. Iontový kanál

Typy membránových receptorů: 2. Receptor s kinázovou aktivitou

Typy membránových receptorů: 3. Receptory spřažené s G-proteiny

G proteiny = proteiny vázající GTP Heterotrimerní G proteiny v aktivním stavu váží GTP regulují mnoho signálních drah a buněčných procesů Monomerní G proteiny = malé G proteiny nebo malé GTPázy aktivita závisí na vázání GTP (aktivní GTP konformace, interakce s efektorem, buněčná odpověď) katalyzují hydrolýzu terminální fosfátové skupiny (inaktivní GDP-proteiny) Heterotrimerní G proteiny = spřažené s receptory 3 podjednotky (α, β, γ) α-pojednotka váže GTP,disociace a interakce s efektorem GTP

Malé GTPázy GDP/GTP-regulované molekulární „přepínače“ (stav „vypnuto“ a „zapnuto“) dva konformační stavy, zásadní pro jejich biologickou funkci: GTP-protein „zapnuto“ GDP-protein „vypnuto“ Regulační proteiny: GEFs (guanine nucleotide exchange factors): urychlují výměnu nukleotidů GAPs (GTPase-activating proteins): urychlují GTP hydrolýzu GDIs (guanine nucleotide dissociation inhibitors): inhibují výměnu nukleotidů

Klasifikace malých GTPáz Známo přes 150 proteinů Ras nadrodina příbuzných proteinů, rodiny malých GTPáz: Ras, Rab, Rho, Arf, Rad, Ran, Rheb, Rit

Lipidová posttranslační modifikace malých GTPáz (prenylace) Farnesyltransferasa (Ras): kovalentní navázání C-15 farnesyl isoprenoidu (F) na cystein motivu CAAX Geranylgeranyltransferasa I (Rho): kovalentní navázání C-20 geranylgeranyl isoprenoidu na cystein motivu CAAX Geranylgeranyltransferasa II (Rab): kovalentní navázání C-20 geranylgeranyl isoprenoidu na cystein motivů CC, CXC, CCX, CCXXX

Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) Regulují aktivaci malých GTPáz a návaznou buněčnou odpověď Usnadňují výměnu volného GTP za vázaný GDP

Různé extracelulární signály aktivují Ras pomocí aktivace odlišných Ras GEFs Všechny Ras GEFs mají CDC25 homologickou doménu, která katalyzuje výměnu nukleotidů Různé Ras GEFs jsou aktivovány odlišně

GTPase activating proteins (GAPs) Urychlují hydrolýzu malých GTPáz Obsahují katalytickou doménu a přídavné domény důležité pro regulaci Mutované Ras proteiny u lidských karcinomů (substituce glycinu 12 nebo glutaminu 61) - nereagují na GAPs stimulaci - přetrvává konformace „zapnuto“ - deregulace buněčných dějů

Struktura malých GTPáz Funkční domény H-Ras G doména: 4 sekvence, odpovědná za vázání GTP a GTPázovou aktivitu Motiv CAAX: Ras a Rho Efektorová doména: vazba s efektorem Switch I a II: odpovědné za změnu konformace mezi GDP a GTP- proteinem RHO sekvence

Různé funkce malých GTPáz Přehled funkcí některých malých GTPáz Rozdílné spektrum buněčných funkcí 1. Různé GEFs a GAPs, které jsou aktivovány primárním signálem 2. Různé efektory, které vyústí v mnoho odlišných buněčných odpovědí Přehled funkcí některých malých GTPáz Ras: buněčná proliferace a diferenciace Rab, Arf, Sar: membránový transport (sekrece, endocytosa) Ran: regulátor nukleocytoplasmatického transportu Rho: cytoskelet (regulace metabolismu aktinu), buněčná morfologie, buněčný pohyb

Funkce: buněčná proliferace a diferenciace Ras GTPázy Funkce: buněčná proliferace a diferenciace Časté mutace Ras proteinů u nádorů (nejvíce studovány) Mutace, které blokují GAPs a hydrolysu GTP, udržují Ras proteiny v poloze „zapnuto“ (nalezeny u různých tumorů)

Ras funguje jako signální uzel Efektory Ras proteinů Ras funguje jako signální uzel 1. Konvergují v něm různé signály: Růstové faktory (epidermální růstový faktor, destičkový růstový faktor) Hormony (insulin) Cytokiny (interleukin-1) Proteiny extracelulární matrix (přes integriny) 2. Aktivuje rozdílné efektory a buněčné děje: Raf serin/threonin kináza (aktivuje Raf/Mek/Erk kinázovou kaskádu – regulace buněčného růstu) Fosfatidylinositol 3 kináza (tvorba PIP3 – regulace různých drah) Fosfolipáza Cε (tvorba druhých poslů DAG a Ca2+) GEFs jiných GTPáz (kaskády malých GTPáz – Ral, Rac, Rab)

Funkce: membránový transport Rab GTPázy (Ras homologue from brain) Funkce: membránový transport Největší rodina malých GTPáz (minimálně 60 proteinů) Lokalizovány v organelách zapojených do sekreční a endocytické kaskády

Buněčná lokalizace Rab GTPas

Mutace Rab genů-poruchy membránového transportu-onemocnění Rab proteiny a nemoci Mutace Rab genů-poruchy membránového transportu-onemocnění Griscelli syndrom (AR) Pigmentové defekty (albinismus), porucha imunity, neurologická dysfunkce Mutace genu Rab27a (reguluje transport melonosomů do periferie melanocytů a sekreci lytických granul v T-lymfocytech) způsobí ztrátu pigmentace a nekontrolovanou aktivaci T-lymfocytů Choroideremie (X vázaná) Degenerace pigmentového epitelu oka Defekt REP-1 genu (geranylgeranyl transferasa zodpovědná za prenylaci Rab27a v retinálním pigmentovém epitelu) vede k deficitu melanosomového transportu v pigmentovém epitelu a ztráta ochrany před světlem

Rho GTPázy Rodina proteinů regulující metabolismus aktinu Funkce: Regulace aktinového cytoskeletu (buněčný tvar a pohyb) Modulace nejrůznějších buněčných dějů: 1. Buněčná migrace: regulace metabolismu aktinu, koordinace aktivace mnoha Rho proteinů 2. Sekrece a endocytosa: transport vesikulů 3. Proliferace a transformace: úloha je zkoumána, invaze nádorových buněk

Rho GTPázy Efektory Funkce v buněčné biologii RhoA, B, C ROCK I, II Aktin-myosinová kontraktilita, buněčná migrace Rac1, 2, 3 IRSp53 Polymerizace aktinu, tvorba lamelipodií, hybná síla buněčné migrace Cdc42 WASP/N-WASP Polymerizace aktinu, tvorba filopodií, sensorická úloha v buněčné migraci

Model Rho GTPasové aktivace efektoru Cdc42 navozená WASP aktivace a tvorba filopodií

Otázky Princip funkce malých GTPáz, jejich cyklus, regulace, aktivace Nejznámější rodiny malých GTPáz (funkce) Princip lipidové posttranslační modifikace Struktura malých GTPáz Důsledek mutací Ras proteinů u lidských karcinomů Funkce Rab a Rho proteinů