Chromozómy a jejich aberace RNDr.Radek Trojanec, Ph.D. Laboratoř experimentální medicíny (LEM) CYTOGENETICKÁ LABORATOŘ www.LEM-Olomouc.cz

ZÁKLADNÍ TYPY CYTOGENETICKÝCH ABERACÍ LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE ZÁKLADNÍ TYPY CYTOGENETICKÝCH ABERACÍ

Změny (aberace, mutace) LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Numerické: aneusomie, polysomie: Pataův syndrom (trisomie 13, viz obr.), Downův sy. (trisomie 21), Edwardsův sy. (trisomie 18), aneusomie gonosomů (Klinfelterův sy. 47,XXY; Turnerův sy. 45,X atd.), onkologická onemocnění apod. Strukturální: delece, translokace, amplifikace, inverze apod.: Cri du chat sy.(sy.kočičího křiku; 5p-), retinoblastom,onkologická onemocnění apod. http://www.rodina.cz Jiné poruchy: uniparentální disomie (Prader-Willi sy.), syndromy chromosomální instability (xeroderma pigmentosum, ataxia telangiectasia) apod.

Downův syndrom incidence 1: 600-800 Trizomie chromozómu 21 při narození: hypotonie, šikmé oční štěrbiny, anomálie uší, ploché záhlaví, opičí rýha, epikantus (vnitřní koutek), srdeční vady, vady dalších orgánů fenotyp starších jedinců: mentální retardace, hypogenitalismus ♂, porucha dentice, krátké, široké ruce, brachydaktylie, poruchy imunity, vyšší riziko nádorových onemocnění (leukémie) EPICANTUS www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf http://www.rodina.cz/g/deti/postizeni/dite_down_syndrom.jpg

Klinefelterův syndrom 47, XXY incidence: 1: 1000 vysoká postava, průměrná inteligence, psychosexuální orientace mužská, hypoplázie testes, kryptorchismus, sterilita – azoospermie, gynekomastie www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

Supermale 47, XYYY mohutnější vzrůst, vysoká postava, průměrná inteligence, pohlavní vývoj normální, plodnost normální, neuvádí se vyšší riziko chromosomálních aberací pro potomstvo, neprokázán narušený psychosociální vývoj www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf dvojčata, vyšší 47, XYY

Turnerův syndrom 45, X incidence 1: 5000 – 10000 malý vzrůst – možnost hormonální terapie, gonadální dysgeneze, primární amenorea, normální inteligence, krátký, široký krk (pterygium colli), nízká vlasová hranice, štítovitý hrudník, edémy na HK i DK (novorozenci) www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

Balancované změny: „obsah“ DNA v buňce se nezmění LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Balancované změny: „obsah“ DNA v buňce se nezmění Nebalancované změny: v „obsahu“ DNA přebývají či chybí sekvence

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Delece: znamená ztrátu genetického materiálu. Může se jednat o deleci celých částí chromozomů, či například jen určitého genu

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Inzerce, duplikace : přidání genetického materiálu (párů bází) do DNA v chromozomu

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Amplifikace: specifický způsob přidání DNA sekvencí: Jedná se o zmnožení konkrétního genu v rámci chromozomu či určitého úseku v  chromozomu

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Inverze: vzniká po dvojnásobném zlomu v témž chromozomu. Příslušný úsek vymezený zlomy se z chromozomu odštěpí a připojí převrácený o 180°. Důsledkem je juxtapozice (přiblížení) určitého genu k jinému, což může způsobit tvorbu chimerického proteinu či kontrolu genu jiným promotorem.

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Translokace: vzniká výměnou úseků mezi různými chromozomy. Její důsledky jsou podobné, jako u inverze

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Ring chromozom: Je-li chromozom porušen 2 zlomy a následně spojen, vzniká kruhová struktura. Je-li v tomto útvaru zachována centromera, může být ring chromozom i mitoticky aktivní.

Angelmanův syndrom: absence mateřské kopie části chromosomu 15 LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Genomický imprinting je proces, kdy je aktivita určitého genu regulována v závislosti na tom, od kterého rodiče byl gen zděděn. Ve většině případů to znamená, že pouze maternální nebo paternální alela je exprimována (je aktivní), kdežto druhá je utlumena. Uniparentální disomie - oba chromozómy v páru původem od jednoho rodiče) Angelmanův syndrom: absence mateřské kopie části chromosomu 15 Prader-Williho syndrom: Absence otcovské kopie části chromosomu 15

Angelmanův syndrom: „Happy puppet“, „Syndrom šťastného dítěte“ LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Angelmanův syndrom: „Happy puppet“, „Syndrom šťastného dítěte“ Nejčastěji:neschopnost mluvit, pouze minimum slov, komunikují nonverbálně, nonverbální komunikace převyšuje verbální opoždění psychomotorického vývoje, těžký zpomalený  vývoj problémy s pohybem, koordinací chůze a stabilitou nonverbální komunikační schopnosti jsou mnohem lepší než verbální mávání a vyvažování horními končetinami, vibrující paže zvláštní chování, velmi často se usmívá, obvykle má šťastnou náladu, v excitaci mává a tleská rukama www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

Prader- Williho syndrom - NOVOROZENCI, KOJENCI: těžká hypotonie, neprospívání, opoždění vývoje, faciální dysmorfie POZDNĚJŠÍ VĚK: mentální retardace, polyfagie – těžká obezita, hypogenitalismus, poruchy chování www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE CYTOGENETICKÝ ZÁPIS

ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer LG., Tommerup N. (eds); Karger S., Basel 2005 LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE add = Addition material of unknown origin del = Deletion de novo = A chromosome abnormality which has not been inherited der = Derivative Chromosome dic Dicentric dup = Duplication fra = Fragile Site idic = Isodicentric chromosome ins = Insertion inv = Inversion i or iso = Isochromosome mar = Marker chromosome mat = Maternal origin Minus sign (-) = Loss mos = Mosaic p = Short arm of chromosome pat = Paternal origin Plus sign (+) = Gain q = Long arm of chromosome r = Ring chromosome rcp = Reciprocal rea = Rearrangement rec Recombinant chromosome rob = Robertsonian translocation t = translocation tel = Telomere (end of chromosome arm) ter = Terminal end of chromosome upd = Uniparental disomy

46,XX - Normal Female Karyotype 46,XY - Normal Male Karyotype These descriptions say there are 46 chromosomes and that it is a male or female. 46,XX,del(14)(q23) Female with 46 chromosomes with a deletion of chromosome 14 on the long arm (q) at band 23. 46,XY,dup(14)(q22q25) Male with 46 chromosomes with a duplication of chromosome 14 on the long arm (q) involving bands 22 to 25. 46,XX,r(7)(p22q36) Female with 46 chromosomes with a 7 chromosome ring. The end of the short arm (p22) has fused to the end of the long arm (q36) forming a circle or 'ring' 47,XY,+21 Male with 47 instead of 46 chromosomes and the extra chromosome is a 21. (Down Syndrome)

VYŠETŘOVACÍ METODY PŘÍKLADY VYŠETŘENÍ ONKOGENETICKÝCH MARKERŮ LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE VYŠETŘOVACÍ METODY PŘÍKLADY VYŠETŘENÍ ONKOGENETICKÝCH MARKERŮ

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

Význam v prenatální dg. i v onkologii: RFC gen LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Význam v prenatální dg. i v onkologii: RFC gen (Reduced Folate Carrier Gene)

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Metodou  fluorescenční in situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in situ). Metoda FISH je založena na schopnosti jednořetězcové DNA sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle.

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE E.Kočárek et al.:Vybrané kapitoly z lékařské cytogenetiky a genetického poradenství; Ústav biologie a lékařské genetiky FN Motol a UK 2.LF (2004)

WCP –Whole Chromosome Painting (celochromozómové sondy) LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

Jádro s normálním počtem kopií genu a chromozomu LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY Jádro s normálním počtem kopií genu a chromozomu CEP 17 Her-2/neu Nepravá amplifikace (polyzomie) Amplifikace

LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY CEP 17 Her-2/neu

t(15;17)(q22;q11-21) PML-RARA AML M3 (PML) ATRA LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE t(9;22)(q34;q11) Philadelphia (Ph) chromozom (Nowell, Hungerford,1962) BCR-ABL CML, ALL, AML, ST STI-571 (Glivec) t(15;17)(q22;q11-21) PML-RARA AML M3 (PML) ATRA

CGH (Kallioniemi, 1992) LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Mnohobarevná FISH (M-FISH)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Mnohobarevná FISH (M-FISH)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Multicolor banding

Microarrays

Her-2/neu (c-erbB-2) Receptor EGF LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY Her-2/neu (c-erbB-2) Receptor EGF Nejčastěji amplifikovaný onkogen u ca prsu (10-15%) Protein p185HER-2 – souvisí s maligní transformací a agresivitou choroby Pacientky s overexpresí proteinu a/nebo amplifikací genu indikovány k terapii monoklonální protilátkou trastuzumab (Herceptin) Různé metody vyšetření

Vyšetření Her-2/neu (c-erbB-2): IHC x FISH FISH: normální Her-2/neu CEP 17 IHC: 1+ až 2+ FISH: normální nepravá amp. amplifikace IHC: 3+ FISH: amplifikace IHC fotografie byly získány ve spolupráci s Ústavem patologie LF UP

CEP 17 LSI Her-2/neu

Her-/neu (c-erbB-2): amplifikované případy: LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Her-/neu (c-erbB-2): amplifikované případy: senzitivita na antracykliny aplikace Herceptinu TOP2A: Topoizomeráza II  = cíl pro některé typy cytostatik: inhibitory topoizomeráz II tj. senzitivita na antracykliny

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

EGFR1 (Her-1) ca.plic FISH & sekvenace LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE EGFR1 (Her-1) ca.plic FISH & sekvenace aplikace inhibitorů: Cetuximab (Erbitux). Gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva)…

Common Approaches to Targeting HER1/EGFR Various approaches are being investigated to target members of the HER family, particularly HER1/EGFR and HER2. These include receptor sub-type specific monoclonal antibodies (MAbs) and small-molecule TK inhibitors (TKIs), which target the HER axis either outside or inside the tumor cell, respectively. MAbs block the extracellular ligand-binding region of the receptor. Several MAbs are specific for either HER1/EGFR or HER2.1 Different antibody- based approaches use MAbs or HER ligands conjugated with cellular toxins.2 Small-molecule TKIs act at an intracellular level, inhibiting TK phosphorylation and preventing downstream receptor signaling. There are agents that inhibit HER1/EGFR specifically, HER1/EGFR and HER2, or all members of the HER family (pan HER-TK inhibitors).3-5 Agents are being developed to interfere with HER activity at a nuclear level by blocking signal transduction and/or translation. The most promising methods are antisense oligonucleotides, ribozyme-mediated DNA inhibition, and gene therapy.6 1. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792. 2. Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565. 3. Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767. 4. Raymond E, Faivre S, Arman JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23. 5. Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s. 6. Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760. P P TK inhibitors P Anti-ligand- blocking antibodies Ligand– toxin conjugates P Antibody– toxin conjugates Anti-HER1/EGFR- blocking antibodies Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792; Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565; Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767; Raymond E, Faivre S, Armann JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23; Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s; Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760.

Sekvenace DNA A T C C A C G G C T G

Priklad praktickeho vystupu analyzy DNA - detekce bodovych mutaci v sekvenci

CEP 17 LSI Her-2/neu

LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM) LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM) LCM je metoda která umožňuje isolaci buněk z komplexu tkáně. Přístroj VERITAS pro LCM od firmy ARCTURUS.

TECHNIKA LASEROVÉ MIKRODISEKCE LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE TECHNIKA LASEROVÉ MIKRODISEKCE Cytologický preparát adenokarcinomu plic Parafinový/kryořez nádorové tkáně Cytospin, buněčná linie K562

Některé další geny, účastnící se maligní transformace buňky Protoonkogeny rodiny MYC (c-myc, n-myc, l-myc aj.) Geny účastnící se regulace buněčného cyklu a n apotózy (geny pro CDK, CDK-I, cykliny) Tumor-supresorové geny (TP53, RB1) Protoonkogeny rodiny RAS BCL-2 a příbuzné protoonkogeny TOP2A, RARA a jiné