Toxicita nanočástic Miloslav Pouzar Ústav environmentálního a chemického inženýrství UNIVERZITA PARDUBICE 2010

Nanočástice Přírodního původu poly-dispersní systémy půdní koloidy - částice jílů, oxidy a hydroxidy kovů, huminové kyseliny ultrajemné podíly polétavého prachu (airborne UFPs) - mořská sůl nanočástice biologického původu - pyly, mikroorganismy Antropogenního původu - produkované nezáměrně obvykle též poly-dispersní systémy dehet, fulereny a uhlíkové nanotrubice v dýmech znečištění při svařování a plazmovém obrábění kovů Antropogenního původu - produkované záměrně (Engineered - ENPs) obvykle mono-dispersní systémy jednostěnné a vícestěnné uhlíkové trubice (SWNTs, MWNTs), fulereny (C-60) TiO2, MnO, ZnO, Fe2O3 polymerní nanočástice

Příklady použití ENPs Ag TiO2 , ZnO Pt , Pd CNT SiO2 Al2O3 Fe, Fe2O3 antimikrobiální účinky - lednice, vysavače, klimatizace, textil, ..... TiO2 , ZnO UV ochrana - opalovací krémy, nátěry, sluneční brýle, autokosmetika Pt , Pd katalytické vlastnosti - katalyzátory v automobilech CNT elektronika, aditiva do pneumatik, lubrikanty, adsorpce kontaminantů SiO2 ohnivzdorná skla, UV-ochrana, elektronika, farmaceutické produkty Al2O3 baterie, mletí, protipožární ochrana, absorpce kovů, biosorbent Fe, Fe2O3 čištění vody, aditivum do betonu

"Neptej se MĚ, zeptej se Paracelsa" "Jsou nanočástice toxické ?" "Jak už jsem řekl dříve - Všechny látky jsou jedy, nic není nejedovaté. Pouze dávka způsobuje, že látka přestává být jedem. Ale dneska se přeci všichni ptají sira Weba of Science...."

Počet odkazů týkajících se toxicity nanočástic na Web of Science A. Kahru et al. / Toxicology 269 (2010) 105–119

Počet odkazů týkajících se toxicity nanočástic na Science Direct A. Kahru et al. / Toxicology 269 (2010) 105–119

Současná úroveň poznání o toxicitě nanomateriálů Nové nanomateriály (NNm) Data o toxicitě/nebezpečnosti NNm Data o toxicitě/nebezpečnosti NNm vyhodnocená regulačními orgány Čas Objem výzkumu K. Savolainen et al. / Toxicology 269 (2010) 92–104

Opalovací krémy Dunford et al. (2002), McHugh and Knowland (1997) TiO2 / ZnO se podílí na tvorbě volných radikálů v kožních buňkách a na následném poškození DNA těchto buněk Long et al. (2006) EPA nanočástice TiO2 v opalovacích krémech mohou způsobovat poškození mozku u myší Long et al. (2007) EPA NPs TiO2 stimulace vzniku ROS v mozkových mikrogliích a poškození neuronů in-vitro Handy et al. (2008) genotoxické a cytotoxické účinky - ryby

Vstup NPs do organismu Kreyling et al. (2002) iv aplikace radioaktivních NPs 191Ir - distribuce do vnitřních orgánů (potkan) Monteiro-Riviere et al. (2007) penetrace kůže na in-vitro a ex-vivo modelech, důkaz o přestupu NPs TiO2 nejednoznačný Oberdörster et al. (2004) a Elder et al. (2006) inhalované NPs MnO o velikosti 30 nm (potkan) přestup přes zakončení čichových nervů v nosní dutině do čichového laloku předního mozku a z něj pak dále do hlubších struktur mozku (kůra, mozeček) axonální translokace Kreuter (2004) a Elder et al. (2006) NPs potažené polysorbátem přestupují hematoencefalickou bariéru (BBB)

Endoteliální buňky kapilárních stěn Hematoencefalická bariéra Červená krvinka Kapilára Endoteliální buňky kapilárních stěn Těsné spojení Základová membrána Polysorbát (Tween 80) Astrocyty

Oberdörster G. et al., Environmental Health Perspectives 113 (7) 823-839 (2005)

Pulmotoxické účinky NPs Donaldson et al. (2002, 2006); Lam et al. (2004, 2006) intra-tracheální instilace či aspirace suspenzí NPs TiO2 či uhlíkových nanotrubic způsobuje v plicích u myší silnou zánětlivou odpověď i při nízkých koncentracích Shvedova et al. (2007) akutní inhalační expozice uhlíkovým nanotrubicím (SWNTs, MWNTs) - zvýšený počet zánětlivých buněk v broncho-alveolární tekutině potkanů, plicní granulom a fibróza Ma-Hock et al. (2009) tříměsíční inhalační studie na potkanech - uhlíkové MWNTs - vznik granulomů, při všech testovaných koncentracích (0; 0,1; 0,5 a 2,5 mg/m3) Alenius et al. (2010) zesílení zánětlivé reakce v plicích potkanů po úpravě povrchu TiO2 zvyšující hydrofilitu

Pulmotoxické účinky NPs při stejné dávce mají NSPs vyšší schopnost vyvolat zánětlivou reakci než částice větších rozměrů – vliv povrchu TiO2 (anatas) 20 a 250 nm – intratracheální aplikace – potkan po 24 h měřena plicní zánětlivá neutrofilní reakce pro částice stejného složení a různého povrchu je lepší mírou dávky celkový povrch částic, než jejich hmotnost či počet Oberdörster G. et al., Environmental Health Perspectives 113 (7) 823-839 (2005)

Genotoxické účinky NPs SCCP (2007) nevhodnost in-vitro testů (Amesův) gentoxicity používaných pro roztoky genotoxické účinky NPs souvisí se zánětlivým procesem Savolainen et al., Toxicology 269 (2010), 92-104 několik publikací popisujících in-vivo testy genotoxicity uhlíkových nanotrubic (SWCNT, MWNCT) - obvykle nesmyslně vysoké dávkování vliv krystalické formy TiO2 (rutil vs. anatas) na výsledky různých typů in-vitro testů genotoxicity (kometový test, mikrojaderný test) Celkově nízký počet prací, velký počet možných mechanismů, značná časová náročnost

Karcinogenní účinky NPs Takagi et al. (2008) perzistentní částice (Azbest) obvykle vyvolávají lokální tvorbu reaktivních forem kyslíku (ROS), vzniká dlouhodobý zánět  zvýšené riziko rakoviny Savolainen et al., Toxicology 269 (2010), 92-104 celá řada prací popisující schopnost SWCNT a MWNCT indukovat tvorbu ROS při testech in vivo Takagi et al. (2008) schopnost MWCNT vyvolávat mesotheliom u p53 +/+ myší převyšovala účinek azbestu (crocidolit) - obvykle se jednalo o AGLOMERÁTY, intraperitoneální apl. Muller et al. (2009) MWCNT ip, potkan kmen Wistar - žádná indukce mesotheliomu trubice kratší než 5 m - úspěšná fagocytóza makrofágy

Singh N. et al., Biomaterials 30, 3891–3914 (2009) Karcinogenní účinky NPs Singh N. et al., Biomaterials 30, 3891–3914 (2009)

Indukce oxidativního stresu vyvolaná NPs Singh N. et al., Biomaterials 30, 3891–3914 (2009)

Neurotoxické účinky NPs Nel et al. (2006) oxidativní stres a následná zánětlivá odpověď organismu jsou hlavními mechanismy jak NPs poškozují neurony Mates et al. (1999) zvýšená produkce ROS  zvýšené riziko Alzheimerovy, Parkinsonovy a Huntingtnovy choroby Campbel et al. (2005) zvýšená koncentrace NPs v mozkové kůře a hippocampu u nemocných Alzh. Scaper et al. (1999) vysoký obsah snadno peroxidovatelných nenasycených mastných kyselin, vysoká spotřeba kyslíku a relativně nízké % antioxidačních enzymů v mozkové tkáni - vysoká citlivost mozku na zvýšenou tvorbu ROS

Neurotoxické účinky NPs Hu et al., International Journal of Pharmaceutics 394 (2010) 115 - 121

Neurotoxické účinky NPs Wang et al. (2009) negativní vliv Cu-90 a Mn-40 NPs na sekreci dopaminu při in-vitro testech (PC12) Deng et al. (2009) NPs ZnO (20-300 nm) - indukce apoptózy neurálních kmenových buněk - vliv Zn2+ iontu uvolněného uvnitř buněk Lockman et al. (2004) vliv náboje NPs na destrukci BBB - neutrální NPs a nízké koncentrace záporně nabitých NPs bez efektu, destrukce BBB kladně nabitými NPs Ma et al. (2009) při ip aplikaci 150 mg/kg TiO2 během 14 dnů akumulace NPs v mozku myši - oxidativní stres a poškození mozku anatas se akumuluje lépe (500 ng/g) než "bulk" TiO2 (350 ng/g)

Vliv NPs na oběhový systém Nurkiewitz et al. (2008) znečištění ovzduší polétavým prachem má prokázanou spojitost se zvýšeným rizikem úmrtí na srdeční choroby prachové částice větších poloměrů (0,1 - 2,5 m) způsobují při intratracheální expozici u potkanů zánětlivou reakci cévních stěn inhalace nízkých koncentrací NPs TiO2 - microvaskulární disfunkce, trombóza Radomski et al. (2005) inhalace SWCNT a MWCNT - agregace krevních destiček, trombóza Ericson et al. (2008) nanočástice fumagillinu naplněné statinem použity k léčbě aterosklerózy

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78 Faktory ovlivňující toxicitu NPs srovnávací in vitro studie toxicity čtyř druhů nanočástic a odhad možných mechanismů jejich toxického účinku Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78 Faktory ovlivňující toxicitu NPs pro pokus použity PMEF buňky (primary mouse embrio fibroblast) viability test (test přežívání) - živné médium mění zabarvení vlivem enzymatické aktivity buněk Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78 LDH (laktát dehydrogenáza) - enzym, jehož extracelulární přítomnost signalizuje mechanické poškození příslušných buněk Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78 SOD (superoxid dismutáza) - enzym redukující oxidativní stres MDA (malondialdehyd) - produkt reakce ROS a polynenasycených lipidů Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78 Tail DNA - test poškození DNA prováděný pomocí SGCE (single cell gel electrophoresis) Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78 Závěry studie Cytotoxicita a oxidativní stres ZnO (oxid kovu) má výrazně větší cytotoxický efekt, než oxid křemičitý a obě formy uhlíku tvarová podobnost a shodná velikost částic mezi ZnO a SiO2 ukazuje, že vliv na rozdíl v toxicitě má v daném případě chemické složení menší částice CB mají menší cytotoxický a oxidativní efekt než větší částice ZnO rozdílné chemické složení částic vede k jejich rozdílné schopnosti katalyzovat reakce vedoucí k produkci ROS a tím k oxidativnímu stresu, tvar částic má menší vliv než jejich chemické složení Genotoxicita CNTs vykazují větší schopnost poškozovat DNA než ZnO, které je nejefektivnější z hlediska schopnosti vyvolat oxidativní stres mechanismem genotoxického účinku CNTs může být mechanické poškození DNA výrazný vliv tvaru na genotoxické účinky Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Strategie testování toxicity NPs Fyzikálně chemická charakterizace specifický povrch chemická reaktivita úroveň znečištění - těžké a přechodové kovy, organická rozpouštědla apod chování v aerosolech a suspenzích - agregace Stupeň I Testování na acelulárních systémech produkce ROS, RNS apod vyřazení z dalšího testování, pokud je dostupný test s dostatečnou predikční schopností, klasifikace Ne Ano Savolainen K. et al., Toxicology 269 (2010) 92 - 104

Strategie testování toxicity NPs In-vitro testy genotoxicita, imunotoxicita, dermální toxicita, oční toxicita, neurotoxicita, hepatotoxicita Stupeň II Ne vyřazení z dalšího testování, klasifikace Ano In vivo testy imunotoxicita, orgánová toxicita, genotoxiicita, reprodukční toxicita, ADME Stupeň III Ne vyřazení z dalšího testování, klasifikace Ano Savolainen K. et al., Toxicology 269 (2010) 92 - 104

Strategie testování toxicity NPs Pozitivní testy genotoxicity a mutagenity vedou k dlouhodobým in vivo testům karcinogenity a reprodukční toxicity Stupeň IV Daphnia magna přecpaná nanočásticemi TiO2, SWCNT a Daphnia držící dietu....... Savolainen K. et al., Toxicology 269 (2010) 92 - 104