Vnitrobuněčné oddíly Třídění a transport proteinů

Kompartmenty živočišné buňky

Kompartmenty živočišné buňky - TEM

Prokaryotická buňka Eukaryotická buňka

Typická rostlinná buňka Golgiho aparát centrální vakuola vesikul drsné ER ribosomy (na ER) mikrofilamenta ribosomy (volné) hladké ER mitochondrie DNA+nucleoplasma chloroplast jadérko jádro jaderná membrána plasmatická membrána mikrotubuly buněčná stěna

Živočišná buňka Rostlinná buňka

Funkce hlavních vnitrobuněčných oddílů Jádro – obsahuje buněčný genom, syntéza DNA and RNA Cytosol – syntéza proteinů, glykolýza, metabolické dráhy pro syntézu aminokyselin, nukleotidů, etc Endoplasmatické retikulum – syntéza membránových a sekrečních proteinů, syntéza většiny lipidů Golgiho aparát – kovalentní modifikace proteinů z ER, třídění proteinů a lipidů pro sekreci a transport do jiných částí buňky Mitochondrie – syntéza ATP oxidační fosforylací Chloroplasty – syntéza ATP a fixace uhlíku fotosyntézou Lyzosomy – odbourávání látek uvnitř buňky Endosomy – třídění materiálu z endocytózy a GA Peroxisomy – oxidace toxických molekul, beta oxidace mastných kyselin

Tři základní typy vnitrobuněčného transportu proteinů Transport jaderným pórem (Gated transport) Transmembránový transport Vesikulární transport

Mapa transportu proteinů Vznik a správná funkce vnitřních kompartmentů zcela závisí na přesném cílení proteinů.

Třídění proteinů – signální sekvence

Jednoduchý experiment dokazuje, že většina třídících signálů se skládá z krátkého úseku aminokyselinové sekvence nazývané “signální sekvence”.

GFP

Cytoplasmatický Jaderný

Actin-GFP PAX-GFP

Signální sekvence

Jaderný import a export Jaderný obal se skládá ze dvou koncentrických lipidových dvouvrstev. Perinukleární prostor je kontinuální s lumenem ER. Přes komplex jaderného póru probíhá obousměrný transport.

Jaderný pór Komplex jaderného póru je vodní kanál, který umožňuje difuzi malých molekul a proteinů do 60kD. Transport těchto malých molekul je pasivní.

Molekuly větší než 9 nm nebo 60 kDa musí mít jaderný lokalizační signál (NLS) a jsou aktivně transportovány do jádra.

Transport velkých proteinů do jádra vyžaduje signální sekvenci nazývanou jaderný lokalizační signál (NLS). NLS může být umístěn kdekoliv v primární sekvenci proteinu. Obvykle je bohatý na arginin a lysin a je poměrně krátký.

Mechanismus jaderného transportu

NLS směruje proteiny k transportu přes komplex jaderného póru NLS směruje proteiny k transportu přes komplex jaderného póru. Proteiny si během transportu přes jaderný pór zachovávají svou terciální a kvarterní strukturu. Jsou-li částice koloidního zlata potaženy NLS, můžeme vidět částice procházet jadernými póry. Maximální velikost částice zlata, která může být transportována je 26 nm. Jelikož zlaté částice nemohou být stlačeny, otvor jaderného póru musí být schopen se rozšířit.

Protein Ran (monomerická GTPáza) je hnací silou transportu přes komplex jaderného póru Ran-GAP se nachází výhradně v cytoplasmě = Ran-GDP se hromadí vně jádra. Ran-GEF se nachází uvnitř jádra = Ran-GTP se hromadí uvnitř jádra. Ran: Monomerická GTPáza Ran-GAP: GTPázu-aktivující protein Ran-GEF: Guaninový výměnný faktor

Receptory jaderného importu (Nuclear Import Receptors) rozpoznávají NLS.

Transport proteinů do mitochondrií a chloroplastů Organely specializované na syntézu ATP. Většina proteinů je kódovaná jaderným genomem a syntetizovaná v cytoplasmě. Proteiny musí být transportovány do jednoho z kompartmentů nebo membrán těchto organel.

Mitochondriální (chloroplastové) proteiny

Mitochondriální signální sekvence: amfipatický alpha-helix, pozitivně nabitý Proteinové transportéty mitochondriálních membrán

Import proteinů do mitochondriální matrix je řízen N-terminální signální sekvencí. Signální sekvence na N-konci naváže protein na TOM komplex na vnější mitochondriální membráně. TOM komplex je současně receptor pro signální sekvenci a translokátor. TOM komplex s navázaným proteinem se přemístí do tzv. membránového kontaktního místa. Protein prochází přes TOM transportér do transportéru komplexu TIM na vnitřní mitochondriální membráně. Protein je transportován do mitochondriální matrix a signální sekvence (=signální peptid) je enzymaticky odštěpena tzv. signální peptidázou.

Energetika mitochondriálního transportu: hydrolýza ATP a elektrochemický protonový gradient. Hydrolýza ATP – chaperonové proteiny v cytoplasmě Elektrochemický protonový gradient na vnitřní mitochondriální membráně Hydrolýza ATP – chaperonové proteiny v mitochondriální matrix

Transport do chloroplastů je podobný transportu do mitochondrií Transport do chloroplastů je podobný transportu do mitochondrií. Vyjímka – tylakoidy (třetí membrána), potřeba druhé signální sekvence U chloroplastů je protonový gradient na tylakoidní membráně a podílí se zde na transportu do tylakoidů. Transport přes chloroplastovou vnitřní membránu (nemá elektrochemický gradient) využívá energii z hydrolýzy GTP a ATP.

Srovnání jaderného a mitochondriálního importu

Peroxisomy obsahují oxidativní enzymy, odbourávání toxických molekul, beta oxidace mastných kyselin, syntéza prekursoru myelinu, krátká signální sekvence

Endoplasmatické retikulum

drsné ER hladké ER Drsné ER -ribosomy Lumen ER tvoří kontinuální prostor s perinukleárním prostorem. hladké ER

Funkce endoplasmatického retikula Počátek nově syntetizovaných proteinů určených pro Golgi, Endosomy, Lyzosomy, Sekreční vesikuly a Plasmatickou membránu Vytváří orientaci proteinů v membráně Místo syntézy fosfolipidů a cholesterolu Počáteční místo pro N-glykosylaci proteinů Hromadění Ca++ - sarkoplasmatické retikulum ve svalech

Volné a vázané ribosomy

Signální sekvence ~20 aminokyselin, bohatá na hydrofobní aminokyseliny, nejčastěji na N-konci SRP-signál rozpoznávající protein (signal recognition particle) SRP receptor Proteinový translokátor Translace a translokace probíhá současně - ko-translační transport Energie pro transport je získána z vlastního procesu translace – jak polypeptid roste, je protlačován přes proteinový translokátor

Signální sekvence (signální peptid) sekrečních proteinů je odštěpena signální peptidázou.

Translokace proteinů přes membránu ER

Transmembránový protein

Ko-translační transport musí být schopen vytvářet řadu různých konfigurací. For both single-pass and multipass transmembrane proteins, some types will have the N-terminus projecting into the cytosol and others will have the C-terminus projecting into the cytosol.

Membránové proteiny s více transmembránovými doménami

Things can get pretty complicated!

Membránové proteiny ukotvené přes glykolipidy - ER

N-glykosylace proteinů (N-linked glycosylation) Dolichol N-linked glycosylation. Glykosylace – signál pro rozlišení správně složených proteinů

Krevní skupiny ABO jsou určeny dvěmi glykosyltransferázami

Skládání proteinů v ER

Nesprávně složené proteiny jsou exportovány z ER do cytoplasmy a degradovány v proteasomu.

Fosfolipidy jsou syntetizovány na cytoplasmatické straně membrány ER

Fosfolipidové translokátory

Transfer lipidů do jiných organel Jaderná membrána – laterální difuze Organely sekreční dráhy – vesikulární transport Mitochondrie, chloroplasty a peroxisomy – proteinový transport (Phospholipid exchange proteins)

Intracelulární vezikulární transport

Golgiho aparát hraje centrální roli ve vnitrobuněčném vesikulárním transportu

Vesikulární transport přepravuje proteiny a membrány mezi jednotlivými buněčnými kompartmenty Vesikulární transport zachovává membránovou orientaci

Proteiny jsou předávány z ER do Golgiho aparátu.

TEM Golgiho komplexu

Golgiho aparát – trojrozměrná rekonstrukce Proteiny z ER vstupují do Golgiho aparátu na cis straně

Golgiho aparát má dvě hlavní funkce: 1. Modifikuje N-vázané oligosacharidy a přidává O-vázané oligosacharidy. 2. Třídí proteiny – po odchodu z trans Golgi komplexu jsou doručeny do správných buněčných kompartmentů v transportních vesikulech.

Modifikace N-vázaných oligosacharidů je prováděna řadou enzymů Golgiho aparátu. 1. Třídění proteinů 2. Ochrana proteinů před proteázami 3. Buněčná adheze (selectiny) 4. Imunitní systém

Na tvorbě (pučení) vesikulů se podílejí tři typu plášťových proteinů (coat proteins)

Klathrinové váčky

Klathrin se navazuje přes adaptiny na receptory v donorové membráně Klathrin se navazuje přes adaptiny na receptory v donorové membráně. Receptory vážou specifický náklad. Klathrin se sestavuje do kulovitého útvaru a vtahuje s sebou část donorové membrány. Dynamin odškrtí váček od membrány. Požadovaná energie: Dynamin – hydrolýza GTP Chaperonové proteiny - hydrolýza ATP

Cílení transportních vesikulů: komplementární sady SNARE proteinů (v-SNARE a t-SNARE).

Správně složené proteiny jsou transportovány v COPII vesikulech do cis-Golgiho komplexu. COPII plášť je odstraněn a vesikuly vzájemně fúzují – vesikulární tubulární cluster. VTC je transportován podél mikrotubulů za účasti motorových proteinů. VTC fúzuje s cis-Golgi komplexem.

Není zcela jasné, jak proteiny postupují přes Golgiho komplex. 1. Model: Stacionární kompartmenty a vesikulární transport mezi nimi. 2. Model Velké pohybující se kompartmenty, které postupně dozrávají do TGN, zpětný návrat enzymů pomocí vesikulárního transportu.

Konečnou destinací pro některé proteiny z TGN je lyzosom Konečnou destinací pro některé proteiny z TGN je lyzosom. Mezi ně patří především kyselé hydrolázy. Lyzosomy představují „žaludek“ buňky. jedna membrána kyselé hydrolázy degradace makromolekul H+ ATPázová pumpa pH ~5

Makromolekuly degradované v lyzosomech: endocytoza, fagocytoza nebo autofagie.

Endocytoza vs. Exocytoza Základní typy endocytozy: Fagocytoza – velké částice a buňky Pinocytoza – malá množsví extracelulární tekutiny Receptorová endocytoza – seletivní transport membránových receptorů a jejich navázaných ligandů Endocytoza odebírá značné množství plasmatické membrány. Odebrané složky plasmatické membrány jsou nahrazovány procesem nazývaným exocytoza.

Fagocytoza – bílé krvinky: Makrofágy, Neutrofily a Dendritické buňky Receptory v plasmatické membráně (fosfatidylserin)

Pinocytoza – klathrinové váčky

Endocytická dráha - od plasmatické membrány po lyzosom časný endosom multivesikulární tělísko pozdní endosom lyzosom

Transcytosa – transport proteinů přes epitel Transport protilátek z mateřského mléka přes střevní epitel. Kyselé pH ve střevě – vazba protilátky na Fc receptor Neutrální pH extracelulární tekutiny – disociace protilátky z receptoru

Exocytoza

The End